3.4. Поверхностные белки метанотрофов

Из всех известных на данный момент метанотрофов наиболее изученным является типичный представитель этой группы, термотолерант Mc. сapsulatus Bath, у которого определен спектр поверхностных белков и изучены их функции (Ward et al., 2004). При изучении спектра поверхностных белков у Mc. capsulatus Bath изначально были выявлены мембрансвязанные белки МорА, МорВ, МорС, МорD, и МорЕ с предполагаемыми м.м. 27, 40, 46, 59, 66 кДа, соответственно (Fjellbirkeland et al., 1997) . При этом было показано, что МорС и МорD in vivo существуют в виде гетеродимера с общей м.м. 95 кДа, который, предположительно, принимает участие в транспорте ионов меди. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белка MopВ выявил в С-концевой области (между 291 и 306 аминонокислотами) консервативный участок NX2LSX2RAX2VX3L, характерный для белков семейства OmpA (наружных клеточных белков), участвующих в транспорте субстратов и поддержании структуры клеток. В N-концевой области MopВ расположены трансмембранные домены, характерные для мембранных белков.

Гибридизация антител к белку MopE с тотальными клеточными белками и белками культуральной жидкости выявила присутствие белка MopE в биомассе, а в культуральной жидкости - белка 45 кДа. Последующее секвенирование гена mopE и сравнение c N-концевой последовательностью белка 45 кДа, а также Вестерн-блот анализ, показали, что белок 45 кДа является С-концевым пептидом белка MopE, в котором пептид отщепляется после 204 аминокислоты - аланина (Fjellbirkeland, 2001). Количество экскретируемого пептида в среде достаточно велико и достигало примерно 0,4% от биомассы. Сравнение с известными белками выявило единственное сходство лишь в C-концевой области с белком CorA Methylomicrobium album BG8, предполагаемая функция которого состоит в транспорте и аккумуляции ионов меди. Обнаружено, что зрелый белок MopE, обозначенный как MopE^с, и выделяемый в среду 45 кДа пептид, обозначенный как MopE*, синтезируются в ответ на отсутствие или низкое содержание ионов меди в среде культивирования. В отличие от известных медь-связывающих белков, последовательность белка MopE не содержит характерного участка связывания меди: метионин-Х-цистеин-х-х-цистеин (Karlsen et al., 2003, 2011).

Кроме этого, анализ полной нуклеотидной последовательности генома Methylococcus capsulatus Bath выявил в одном опероне с геном mopЕ, непосредственно перед ним, ОРС MCA2590 (Karlsen et al., 2005). Так как этот ген расположен под одним промотором с mopE, экспрессия которого подавляется ионами меди, то и уровень экспрессии МСА2590 также регулируется содержанием меди в среде. In silico анализ гена mca2590 с использованием программ SIGNALP и PSORT показал, что кодируемый им белок после процессинга (расщепление между Ala41и His42) состоит из 732 аминокислот и обладает м. м. приблизительно 78 кДа. В белке МСА2590 выявлены две области, проявляющие высокий процент сходства с цитохромами с-типа, и обладающие цитохром-связывающими мотивами СХ₂СН.

Выравнивание аминокислотной последовательности белка MCA2590 показало его сходство с рядом бактериальных белков с неизвестными функциями (Photobacterium profundum (UniProt: Q6LQ47), Pseudomonas fluorescens (GenBank: ZP_00262397.1), Nostoc punctiforme (GenBank: ZP_00109402.2), а также довольно детально описанной цитохром-с пероксидазой (CCP) Nitrosomonas europaea (UniProt: P55929) и метиламин-утилизирующим белком MauG Paracoccus denitrificans (UniProt: Q51658). Несмотря на то, что с последними двумя белками, относящимися к семейству бактериальных дигемовых цитохром С пероксидаз (ВССР), сходство составляет менее 30%, их различия с МСА2590 практически не затрагивают функциональную область белка. Это позволяет отнести МСА2590 и сходные с ним белки к новой группе бактериальных пероксидаз, отличающихся от ВССР наличием добавочных элементов вторичной структуры. С помощью иммунного анализа и мечения биотином была показана локализация белка MCA2590 на поверхности клеток, что контрастирует с периплазматическим расположением описанных членов семейства ВССР (Karlsen et al., 2008).

Известно, что цитохромы способны удалять суперокид. Окисленный цитохром с может восстанавливаться как дыхательной цепью, так и суперокcидом, и регенерироваться путем окисления естественным акцептором электронов – цитохром с оксидазой. В геноме Mс. capsulatus Bath идентифицированно 57 белков, содержащих гем-связанный мотив, из них 5 - члены семейства цитохромов с₅₅₃₀ и 4 предварительно аннотированы как цитохром с пероксидазы (Bergmann et al., 1999; Ward et al., 2004; Elmorea et al., 2007; Karlsen et al., 2008). Цитохром с пероксидаза из Mс. capsulatus Bath является гомодимером с м. м. субъединиц 35,8 кДА и локализована в периплазме. Предположено участие этого фермента в детоксикации Н₂О₂ и окислении метиламина (Zahn et al., 2001).

В промоторной области выше 5^/ от MCA2590 обнаружена консенсусная последовательность, связывающая сайт транскрипционного фактора Fnr, 5^/-TTGATN(4)ATCAA-3^/, который регулирует (ан)аэробно-зависимую генную экспрессию в γ-протеобактериях. Продукт fnrA гена у Pseudomonus stutzeri контролирует экспрессию цитохрома cbb3, являющегося терминальной оксидазой, а также цитохром с пероксидазы и кислород-зависимой копропорфириноген III оксидазы.

С помощью иммунного анализа и биотинилирования показана локализация белка MCA2590 на поверхности клеток, что контрастирует с периплазматическим расположением всех описанных членов семейства дигемовых цитохром с пероксидаз. Хотя цитохром с пероксидазы выполняют защитную роль в периплазме, восстанавливая пероксиды, образуемые в окислительном метаболизме, увеличенный размер белка и его внеклеточная локализация подразумевают другие физиологические функции (Karlsen et al., 2005).

При изучении белков, участвующих в транспорте ионов меди, у Mm. album BG8, обнаружены три репрессируемых ионами меди мембранных белка, обозначеных Cu₁^rep, Cu₂^rep и Cu₂^rep с м. м. 28.5 и 33, и 49,5 кДа, соответственно (Berson et al., 1997). При этом в наибольшем количестве при снижении концентрации Сu²⁺ в ростовой среде синтезировался белок Cu₁^rep, обозначенный как CorA, о чем свидетельствует профиль тотальных клеточных белков, выявляемый ДСН-ПААГ-электрофорезом. Анализ транслированной аминокислотной последовательности гена corA показал наличие N-концевого сигнального пептида и семи предполагаемых гидрофобных трансмембранных участков. Сравнение с последовательностями известных белков из базы данных выявило небольшое сходство (около 17,5% идентичности при сравнении 126 аминокислот в N-концевой последовательности) с белками кальциевых каналов человека и кролика. Кроме того, геном corA показал высокий процент его сходства c Cu²⁺-репрессибельным белком MopE Methylococcus capsulatus Bath (Fjellbirkeland et al., 1997). Это позволяет предположить, что белок CorA также является поверхностным, хотя детально его локализация не исследовалась.

Белок CorA оказался жизненно важным для метанотрофа, так как мутация по данному белку приводила к замедленному росту и неспособности мутантного штамма расти в жидкой среде. При этом добавление в среду меди в различных концентрациях не улучшало рост, указывая на возможное участие CorA не только в транспорте меди, но и в других жизненно важных функциях клеток (Berson et al., 1997; Karlsen et al., 2008).

У аэробных метанотрофов клеточная оболочка имеет типичное для грамотрицательных бактерий строение и включает цитоплазматическую мембрану, периплазму, слой пептидогликана и наружную мембрану. Вместе с тем наружная мембрана метанотрофов отличается по химическому составу от других грамотрицательных бактерий, поскольку существенной частью ее липидов являются редко встречающиеся у прокариот стеролы и гопаноиды, что может быть связано с использованием метана (Малашенко с соавт., 1978; Bodrossy et al., 1995). Биосинтез стеролов очень редко встречается у прокариот и их наличие было впервые показано у Mc. сapsulatus Bath. Были обнаружены 4-метил-l-5 -холест-8(14)-ен-3-ол, 4,4-диметил-5-холест-8(14)-ен-3-ол, 4-метил-5-холест-8(14)24-диен-3-ол и 4,4-диметил-5-холест-8(14),24-диен-3-ол (Lamb et al., 2007). Благодаря расшифровке генома Mc. capsulatus Bath, был идентифицирован путь биосинтеза стеролов.

3.5. S-слои метанотрофов

В целом, работы, посвященные S-слоям метанотрофов, на данный момент ограничиваются лишь микроскопическими исследованиями. Ранние исследования показали, что у Mc. capsulatus Texas непосредственно под капсулой расположены S-слои, примыкающие к наружной мембране клеточной поверхности. S-слои имеют отчетливо выраженное периодическое строение с тетрагональной р4-симметрией образующих их белковых субъединиц, характеризуются постоянным поперечным размером (60Å), и, по-видимому, нековалентно связаны с наружной мембраной клетки (Сузина, Фихте, 1986). Молекулярная масса формирующих S-слои белковых субъединиц составляет около 130 кДа. У Mc. capsulatus sp. 874 S-слои также имели тетрагональную симметрию (Тюрин с соавт., 1985).

Поверхностные слои с периодической исчерченностью обнаружены у ряда штаммов Methylosinus trichosporium (Сузина с соавт., 1986). Эти слои образуются клетками только в позднем стационаре, тип их симметрии и природа не выявлены. У Methylocystis echinoides обнаружены трубчатые образования белковой природы, расположенные радиально на клеточной поверхности ассоциированные с клеточной стенкой (Гальченко с соавт., 2001). Диаметр этих трубочек у Methylocystis echinoides достигала 40 нм при длине от 0,03 – 0,4 мкм до 1,2 мкм при фиксации глутаральдегидом клеток, выращенных на плотной среде (Сузина и др., 1986). Функция этих причудливых структур на данный момент неизвестна.

Mm. album BG8 имеет S-слои в виде чашевидных образований диаметром 45-55 нм и глубиной около 60 нм. Эти структуры расположены в гексагональной (p6) симметрии и покрывают всю поверхность клетки. Показано, что в центре каждого “бокала” расположена белковая глобула, а стенки бокалов сформированы фибриллярными белками (Berson et al., 1997; Karlsen et al., 2010).

Электронно-микроскопические исследования галофильных и алкалофильных метанотрофов рода Methylomicrobium выявили поверхностные S-слои двух типов организации: двухмерной (плоскостной) с расположением составляющих субъединиц в наклонной (р2) симметрии у Mm. modestohalophilum 10S, и трехмерной в виде монослоя чашевидных структур, расположенных в гексагональной (р6) симметрии у Mm. alcaliphilum и Mm. buryatense (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001). Чашевидные структуры у последних двух видов несколько отличаются по морфологии (по высоте и диаметру). S-слой у Methylomicrobium kenyense AMO1 представлен монослоем мелких конусовидных структур, уложенных на клеточной поверхности в гексагональной симметрии (Sorokin et al., 2000). Такой способ организации S-слоев ранее не был описан у метанотрофных бактерий.

Поверхностные структуры особенно четко видны после фиксации клеток рутениевым красным, что свидетельствует о наличии в их составе полисахаридов. Выделенные поверхностные клеточные структуры штаммов 10S и 20Z содержали в основном белки (80 и 96% соответственно). Анализ очищенных белков показал, что они преимущественно состоят из кислых и гидрофобных аминокислот, тогда как серосодержащие аминокислоты (цистеин и метионин) представлены в минорных количествах. Углеводный компонент у штамма 20Z состоял в основном из глюкозы (92%), а у штамма 10S – также галактозы (76 и 14% соответственно). При электрофорезе в полиакриламидном геле проявлялась только одна белковая полоса с м.м. 27 кДа у Mm. modestohalophilum 10S. Напротив, у штамма 20Z было выявлено несколько белковых полос 10-45 кДа, что отражает более сложный белковый состав S-слоя чашевидных структур.

Итак, присутствие S-слоев, расположенных на поверхности клеток в различной симметрии – р4, р2 или р6 оказалось важной особенностью солезависимых метанотрофов. Возможно, они выполняют функции каркаса, определяющего ригидность клеточного конверта, предотвращая лизис клеток в условиях изменяющегося осмотического давления. Предполагалось, что S-слои галоалкалофильных метанотрофов могут быть своеобразными пориноподобными молекулярными ловушками метана в условиях, ограничивающих его растворимость (высокая соленость и высокая температура). Это предположение согласуется с присутствием S-слоев у термотолерантного Mc. сapsulatus (Тюрин с соавт., 1985). Этот факт косвенно подтверждает предположение о повышенной растворимости метана в матриксе S-слоев (Калюжная с соавт., 1998). Поверхностные структуры особенно четко были видны после фиксации клеток рутениевым красным, что свидетельствует о наличии в их составе полисахаридов.

Хотя в настоящее время нуклеотидные последовательности геномов многих метанотрофов известны, включая Mc. сapsulatus Bath, Mm. album BG8 и Mm. alcaliphilum 20Z, однако гены, кодирующие белковые компоненты S-слоев, не идентифицированы.

Исследование поверхностных белков и кодирующих их генов у метанотрофов представляет интерес для продукции полезных белков посредством гетерологичной экспрессии. Это перспективно ввиду непатогенности метанотрофов, низкой протеазной активности и способности достигать высокой плотности клеток при культивировании на простых средах. Кроме того, изучение поверхностных белков и их функций у метанотрофов с различными физиолого-биохимическими особенностями может привести к лучшему пониманию роли клеточной оболочки в адаптации этих бактерий к флуктуациям природных условий. Необходимы дальнейшие молекулярно-генетические и цитобиохимические исследования для понимания истинной роли S-слоев в адаптации метанотрофов к различным экстремальным условиям обитания.

1