Очистка і характеристика целобіаз із мікробних джерел 11

Мікроорганізм - продуцент	Методи виділення і очистки	Характеристика
Aspergillus tеreus	Осадження сульфатом амонію, іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі і SР-сефадексі, сефадексі G-200	Фермент, що володіє целобіазною і арил-β-глюкозидазною активностями
Aspergillus aculeatus	Осадження етанолом, хроматографія на ДЕАЕ- і SР-сефадексі, гель-фільтрація на Сефакрилі S-200 і ізоелектрофокусування	Виділено з β-глюкозидази, є глюкопртеінами.Дві здатності розщеплювати целоолігосахариди
Trichoderma koningii	Хроматографія на Ультрагелі АсА-44, іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ- і SЕ-сефадексі, конканавалін-А-сефа-розі	Вивчена субстратна специфічність двох целобіаз по відношенню до целоолігосахаридів
Aspergillus niger	Осадження сульфатом амонію, гель-фільтрація на Сефакрилі S-200	Фермент складається з двох субодиниць з Mr 84 кДа
Trichoderma reesei	Фракційне осадження сульфатом амонію, афінна хроматографія на порошковій целюлозі, хроматографія на ДЕАЕ-сефадексі, сефакрилі S-200	Фермент проявляє целобіазну і β-глюкозидазну активність
Humicola insolens	Гель-хроматографія на Сефадексі G-50 і G-100, іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-сефадексі	Містить 2,5% вуглеводів
Geotrichum candidum	Гель-фільтрація на Сефадексі G-50, ізоелектрофокусування на колонці, хроматографія на Cефадексі G-200 і ДЕАЕ-сефадексі	8 целобіаз і β-глюкозидаз зі змішаню субстратною специфічністю

Целобіогідролаза відщеплює целобіозу (основний продукт) з кінця полімерних молекул нативної або частково гідролізованої целюлози, іноді разом із целобіозою утворюється невелика кількість глюкози (мінорний продукт), а також інші целоолігосахариди. Целобіаза (β-глюкозидаза) відщеплює кінцеві нередукуючі залишки β-D-глюкози. Фермент може гідролізувати β-D-глюкозиди та целобіозу, при чому швидкість гідролізу зменшується із збільшенням кількості залишків глюкози в целоолігосахариді.

9.2.2. Технологічні особливості застосування целюлаз у процесах біоконверсії целюлози. Відомі різні модифікації реакторів для проведення ферментативного гідролізу целюлози. Їх умовно можна розділити на три типи: реактор періодичної дії (як правило з перемішуванням), проточний реактор з перемішуванням (часто з ультрафільтраційною мембраною) і проточний колонний реактор безперервної дії (різновиди реакторів наведені на рис. 9.2).

Рис. 9.2. Реактори, які використовуються для ферментативного гідролізу з перемішуванням(І), ультрафільтрацією(ІІ), поршневої течії(ІІІ): 1 – традиційний, 2 – стирання; 3 – зрізання; 4 – з вбудованою ультрафільтраційною мембраною, який працює під тиском; 5 – з виносною зоною ультрафільтрації; 6 – протиточний реактор колонного типу.

Найчастіше використовується реактор періодичної дії з перемішуванням, у який поміщають субстрат і розчин целлюлазного препарату, а процес гідролізу ведеться протягом певного часу з однієї й тією же вихідною порцією субстрату й ферменту. За такої конструкції реакторів виникає проблема відокремлення продуктів реакції від ферментів, а також відокремлення непрогідролізованого залишку сировини. Крім того, швидкість реакції значно зменшується згодом через інгібування продуктами – глюкозою і целобіозою – та інактивації ферментів при перемішуванні. Для відводу продуктів із зони реакції запропоновано використовувати ультрафільтрацію і додавати в реактор у міру гідролізу свіжі порції субстрату. При цьому ферменти затримуються ультрафільтраційною мембраною і залишаються в реакторі, що дозволяє продовжити строк їхньої дії. Ультрафільтраційні мембрани бувають вбудованого типу (тобто перебувають у зоні реактора, де проводиться гідроліз), а також можуть бути виконані у вигляді виносного модуля (рис. 9.2, 5). Використання реакторів мембранного типу ІІ доцільно здійснювати в режимі з підживленням сировини. Реактори здрібнювання являють собою різновид реактора перемішування й дозволяють збільшити у 1,5...2,0 рази ефективність ферментативного гідролізу, хоча мають ті ж недоліки, що й реактор перемішування. Відомий реактор здрібнювання (стирання), що представляє собою реактор перемішування, обладнаний мішалкою із циліндричними сталевими пальцями замість лопат, на 2/3 обсягу заповнений подрібнюючим матеріалом (піском, скляними або сталевими кульками).

Одним з варіантів реактора перемішування є реактор зрізання (рис. 9.2, 3). На валу пропелерної мішалки реактора додатково через рівні проміжки жорстко закріплені диски з отворами, а на внутрішній стінці циліндричного реактора через ті ж проміжки жорстко кріпляться аналогічні перфоровані диски. Диска-леза ротора й статора чергуються, їхній діаметр трохи менше, ніж внутрішній діаметр реактора. Він призначений для гідролізу ЦСМ із розміром часток 0,25...25 мм. У колонних реакторах безперервного типу дії (витиснення або поршневого типу, див рис. 9.2, ІІІ) процес гідролізу здійснюється під дією ферментів, міцно адсорбованих на поверхні субстрату, а розчинні продукти реакції віддаляються з його обсягу потоком буфера. У колонних реакторах концентрація субстрату зазвичай в 2...4 рази вища, ніж у реакторах з перемішуванням і може досягати 200...400 г/л.

Переваги і недоліки різних типів реакторів

Проточний колонний реактор. У реакторі колонного типу можливе використання більших концентрацій субстрату – до 300...400 г/л (для порівняння, у реакторі з перемішуванням – тільки до 80...100 г/л), що приводить до істотного збільшення продуктивності процесу. Постійне видалення продуктів із зони гідролізу дозволяє зменшити їх пригнічуючий вплив на целюлази й у підсумку досягти більше високого ступеня конверсії целюлози й продуктивності. У колонному реакторі можна застосовувати для гідролізу культуральну рідину продуцентів целлюлаз навіть із порівняно невеликою активністю, оскільки принцип роботи реактора дозволяє концентрувати ферменти на поверхні целюлози за рахунок їх селективної (аффінної) сорбції. При цьому відбувається також очищення від домішок, що містяться в культуральній рідини, що в підсумку приводить до одержання більш чистих гідролизатів. Ферменти, які десорбуються в процесі гідролізу і виходять разом із продуктами, можна повторно адсорбувати на свіжих порціях сировини, що подаються у реактор за принципом протитоку. Таким чином, здійснюється авторегенерація ферментів, і процес гідролізу є безперервним, що дає додаткові технологічні переваги.

Недоліками колонного реактора є необхідність використання тільки міцно адсорбованих препаратів целлюлаз, а також високий гідродинамічний опір, що не дозволяє створити досить високу швидкість потоку. Крім того, у колонному реакторі доцільно використати як сировину відносно чисту (делігніфіковану) целюлозу, оскільки лігнін, що накопичується в процесі гідролізу, здатний адсорбувати та інактивувати целюлолітичні ферменти, тобто при підготовці сировини необхідна стадія делігніфікації.

Реактор періодичної дії з перемішуванням. До переваг реактора періодичної дії належить те, що в ньому можна застосовувати ферментні препарати з будь-якою, навіть поганою адсорбційною здатністю, наприклад, целюлазні комплекси з аспергілів з високою целобіазною активністю, які здатні давати як єдиний продукт гідролізу глюкозу (целобіаза погано адсорбується на целюлозі). До переваг реактора можна віднести також простоту апаратурного оформлення й менш жорсткі вимоги до сировини. Недоліками реактора періодичної дії є швидке зменшення швидкості реакції через інгібування продуктами гідролізу, що заважає досягати високого ступеня конверсії, а також низька продуктивність процесу. До того ж мала ефективність використання ферментів, і виникають проблеми відокремлення ферментів від продуктів реакції й подальшого очищення гідролізату.

Проточний реактор з перемішуванням. Даний тип реактора займає проміжне місце між проточним колонним і реактором періодичної дії й поєднує переваги й недоліки останніх.