2.3. Колориметрический метод определения белка (по Лоури)

Реактивы и оборудование: 2 %-ный раствор Na₂СО₃ в 0,1 н NaОН (раствор №1); раствор 0,5 %-ный CuSO₄ х 5Н₂О в 1 %-ном растворе двухзамещённого виннокислого натрия или калия (раствор №2); опытный раствор: готовят смешивая растворы №1 и №2 (50:1 по объёму); реактив Фолина.

Ход работы

К 0,4 мл раствора белка добавляют 2 мл опытного раствора. Смесь перемешивают и через 10 мин приливают к ней 0,2 мл рабочего раствора Фолина. Интенсивность окраски определяют на спектрофотометре при 750 нм через 30мин. Количество белка в растворе находят по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой 100 мг чистого белка (сывороточного γ – глобулина, кристаллического альбумина и др.) растворяют в 100 мл 0,1 н NaОН (1 мл содержит 1 мг белка). В 9 мерных колб приливают раствор белка в возрастающих количествах: 0,5 мл, а затем от 1 до 8 мл. Раствор в колбах доводят водой до объема 10 мл, перемешивают и из каждой колбы берут по 0,4 мл для определения белка. По полученным данным вычерчивают калибровочную кривую.

Примечание. Определение белка данным методом в растительных объектах, содержащих фенолы, приводит к завышению результатов, так как они образуют аналогичную окраску с реактивами. Перед определением белка для удаления фенольных соединений необходима обработка ацетоном, охлаждённым до –10^оС.

2.4. Определение белка колориметрическим методом

Реактивы и оборудование: в стеклянную пробирку помещают пипеткой 1 мл раствора молока, приливают 20 мл раствора красителя и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают её содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз.

Следует избегать встряхивания, так как при этом образуется трудноразрушимая пена.

Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при частоте вращения 1000 об/мин в течение 20 мин.

Отбирают пипеткой 1 мл надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают колбу до метки водой и содержимое перемешивают. Аналогичным способом разбавляют раствор красителя в 50 раз.

Измеряют на фотоколориметре оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленному содержимому мерной колбы.

Массовую долю белка (Б), %, вычисляют по формуле:

Б=7,78Д-1,34,

где Д – измеренная оптическая плотность, ед. оптической плотности;

7,78 – эмпирический коэффициент, % / ед. оптической плотности;

1,34 – эмпирический коэффициент, %.

Контрольные вопросы.

1. Понятие пищевой и биологической ценности. Что такое степень перевариваемости?

2. Аминокислотный скор. Понятие «эталонный» белок. Какие белки наиболее близки к эталонному? Лимитирующие аминокислоты.

3. Полноценные и неполноценные белки. Привести формулы 8 незаменимых аминокислот.

4. Превращения белков при производстве продуктов питания.

5. Сущность биуретовой реакции.

6. Азотистый баланс. Виды.

ТЕМА «ЛИПИДЫ»

Лабораторная работа №3.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

ПИЩЕВЫХ ЖИРОВ

Цель работы: определение химических показателей образцов пищевых жиров, изучение их фракционного и жирнокислотного состава.

Известно, что жиры животного и растительного происхождения представляют собой сложный комплекс органических соединений. Основной составной частью всех жиров являются сложные эфиры трехатомного спирта – глицерина и жирных кислот, называемые триглицеридами. Такие сложные эфиры имеют следующую общую формулу:

Естественные жиры в большинстве случаев представляют собой смесь разнокислотных триглицеридов. Однокислотные триглицериды в жирах бывают лишь в том случае, если одной из кислот значительно больше, чем остальных.

Однокислотные триглицериды чаще встречаются в животных жирах, чем в растительных. Так, например, в бараньем сале содержание триглицеридов насыщенных кислот (стеариновой и пальмитиновой) составляет 26% и триглицеридов ненасыщенных кислот (олеиновой и линолевой) 4%.

Состав и свойства жиров зависят от источника и способа выделения. Для характеристики качества и природы жира используют комплекс физических и химических показателей.

К числу основных физических показателей относится температура плавления. Температурой плавления жира называется температура, при которой он из твердого состояния переходит в жидкое. Поскольку натуральные жиры представляют собой смеси глицеридов, имеющие различные температуры плавления, переход их в жидкое состояние происходит в пределах некоторого интервала температур. На температурах плавления того или иного жира сказываются специфические особенности глицеридов и их жирнокислотный состав. У насыщенных жирных кислот температуры плавления возрастают с увеличением молекулярной массы. У ненасыщенных – на температуру плавления влияют не столько двойные связи, сколько их положение в цепи и пространственное расположение отдельных частей молекулы.

Процессы, происходящие в липидах при их хранении и переработке, характеризуются так называемыми константами, или химическими и физическими числами жира. Определение этих констант позволяет контролировать не только качество жиров и масел, но и в какой-то степени его натуральность, регулировать технологические режимы получения продуктов.

Среди химических показателей особое значение имеют кислотное число, число нейтрализации, число омыления, эфирное число, йодное число, перекисное число.

Кислотное число (КЧ) – количество миллиграммов едкого кали (КОН), необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Кислотное число жира зависит от его качества, способа получения, условий хранения и других факторов.

Кислотное число является важнейшим показателем качества пи­щевых жиров, показывает глубину гидролитического распада и нор­мируется ГОСТом и техническими условиями. Например, если масло получено из зрелых семян, то свободных жирных кислот в нем мало, а в масле из незрелых семян содержание свободных жирных кислот значительно.

При несоблюдении условий и сроков хранения жиров кислотное число увеличивается, что обусловлено в основном гидролизом триацилглицеринов. Свободные жирные кислоты окисляются быстрее, чем связанные. Таким образом, кислотное число может повышаться в результате окислительного и биохимического прогоркания ненасыщенных жирных кислот. Однако повышенное кислотное число не всегда может служить признаком порчи жира. Часто жиры с высоким кислотным числом не бывают прогорклыми, в то же время кислот­ное число прогорклых жиров может быть небольшим. Кислотное число нерафинированных масел выше, чем рафинированных.

Кислотное число подсолнечного масла (мг КОН/г):
Рафинированного	0,40
рафинированного гидратированного	1,25
гидратированного 1-го сорта	2,25
гидратированного 2-го сорта	6,00
нерафинированного высшего	1,50
нерафинированного 1-го сорта	2,25
нерафинированного 2-го сорта	6,00
Кислотное число соевого масла (мг КОН/г):
рафинированного масла	0,30...1,50

Число нейтрализации (ЧН) – количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации 1 г жирных кислот, что соответствует 100%-ному содержанию свободных жирных кислот в 1 г образца. Число нейтрализации индивидуальных жирных кислот - величина постоянная.

Используя эти два химических показателя (ЧН и КЧ), можно определить содержание свободных жирных кислот в жире (Х), %:

где а – коэффициент пересчета на индивидуальную кислоту.

Число омыления (ЧО) – количество миллиграммов едкого кали, необходимое для омыления глицеридов (связанных жирных кислот) и для нейтрализации свободных жирных кислот, входящих в состав 1 г исследуемого жира. Число омыления – характерный показатель и колеблется для одного и того же сорта масла или жира в узких пределах.

Число омыления зависит от молекулярной массы жирных кислот, входящих в глицериды, содержания неомыляемых веществ, свободных жирных кислот, моно- и диацилглицеринов. Число омыления понижается при повышении содержания неомыляемых веществ моно- и диацилглицеринов и повышается при увеличении свободных и низкомолекулярных кислот. Следовательно, число омыления служит показателем окислительной порчи жира.

Число омыления совместно с кислотным числом является показателем степени окислительной порчи жира, сопровождающейся накоплением низкомолекулярных кислот.

Эфирное число (ЭЧ) – количество миллиграммов едкого кали, необходимое для омыления сложных эфиров, находящихся в 1 г жира. Эфирное число не является постоянной величиной и зависит от изменения кислотного числа.

Для жиров, не содержащих свободных жирных кислот, значения числа омыления и эфирного числа совпадают. При хранении жиров, сопровождающемся процессами гидролиза и окисления, эфирное число снижается.

Йодное число (ЙЧ) – (или так называемый коэффициент непредельности) характеризует степень ненасыщенности жира и выражается количеством йода в граммах, которое требуется для полного насыщения жирных кислот, содержащихся в 100 граммах жира. По величине этого показателя судят о преобладании в жирах насыщенных или ненасыщенных жирных кислот. Чем выше в жире содержание ненасыщенных жирных кислот, тем выше йодное число. Тугоплавкие жиры имеют низкое йодное число, легкоплавкие – высокое.

Характеризуется степень ненасыщенности органических соединений. Для твердых жиров меняется в пределах 35-85, для жидких жиров составляет 150-200.

Йодное число является показателем консистенции сливочного масла и должно учитываться при выборе температурных режимов обработки сливок в процессе их созревания и перемешивания. Оно повышается летом и понижается зимой и лежит в пределах 28-45 г/100 г. Метод основан на способности йода присоединяться по кратным связям. Непрореагировавший йод оттитровывают тиосульфатом натрия.

Перекисное число (ПЧ) служит количественным показателем присутствия первичных продуктов окисления жиров - пероксидов, т. е. окислительных изменений, происходящих в жирах, и выражается количеством йода (в граммах), выделенного перекисями из 100 г жира.

По величие перекисного числа можно судить только о начальной стадии окисления липидов, на которой образуются пероксиды и гидропероксиды, получившие название первичных продуктов окисления. Они не оказывают существенного влияния на органолептические свойства жира. Содержание пероксидов обычно невысоко, так как они быстро превращаются во вторичные продукты окисления, не содержащие пероксидного кислорода. Образующиеся на этой стадии вторичные продукты - многочисленные насыщенные и ненасыщенные альдегиды и кетоны, многие из которых токсичны и придают жирам соответствующие специфические посторонние привкусы. Так, рыбный привкус вызывают насыщенные и ненасыщенные альдегиды (С₅...С₁₁), прогорклый вкус - гептаналь.

По величине перекисного числа можно судить о свежести жира задолго до появления неприятного вкуса и запаха. Концентрацию пероксидных соединений в жирах следует контролировать, так как они токсичны, способны разрушать жирорастворимые витамины и полиненасыщенные жирные кислоты. Первичные продукты неглубокого окисления липидов образуют плохо усваиваемые организмом комплексные соединения с аминокислотами, снижая тем самым пищевую ценность молочного жира.

Методика определения перекисей в жире основана на том, что при взаимодействии жира, содержимого органические перекиси, с йодистоводородной кислотой выделяется йод, который оттитровывается гипосульфитом.