Количественный метод — определение титра фага по Грациа.

Для постановки опыта предварительно: а) разливают пита­тельный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7%) питательный агар, разлитый по 3—4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого фага (10^_2-10^-7, но может бьггь и дальше, в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (КГ⁷) смешивают с таким же объемом суточной бульонной куль­туры чувствительных к фагу бактерий и выливают в про­бирку с полужидким агаром, охлажденным до 45°С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят смесь из следующего разведения фага (Ю^-®) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем —из разведения 10~*. После застыва­ния второго слоя агара чашки инкубируют при 37°С.

Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и осво­бождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаго­вых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна, или негативные колонии фага. Число этих пятен соответствует

количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характери­зующая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5).

Определение спектра литического действия фага. Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуе­мых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей на­носят каплю соответствующей бульонной культуры и распре­деляют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, г^е имеется сплошной лизис бактерий или так называемые стерильные пятна на бактериальном га­зоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на„ квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фаготип бакте­риальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 38).

Определение лизогенин. Исследуемую бульонную культуру центрифугируют с целью отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, он будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявле­ния фага надосадочную жидкость засевают на газон инди­каторной (чувствительной) бактериальной культуры, на кото­ром через сутки инкубации при 37°С образуются очаги лизиса — «стерильные» пятна.

При отрицательном результате опыта исследуемую бакте­риальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.