Метод тонкослойной хроматографии

Хроматография — область науки, изучающая процессы, основан­ные на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке под­вижной фазы и связанные с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов.

В любом варианте хроматографических методов используют сочета­ние неподвижной (стационарной) фазы (НФ) и подвижной фазы (ПФ). Подвижная фаза (газ, жидкость) в процессе хроматографирования непре­рывно перемещается вдоль неподвижной фазы (твердое тело, жидкость), так что частицы хроматографируемых веществ, переносимые вместе с ПФ, могут многократно переходить из подвижной фазы в неподвижную и наоборот. Разделение веществ с помощью хроматографии основано на различном сродстве разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам. Различие в сродстве приводит к различию в скоростях движения частиц разделяемых веществ вместе с подвижной фазой и в конце концов к их разделению.

Пусть, например, вместе с ПФ перемещается смесь раздеваемых компонентов А и Б, причем компонент Б имеет большее сродство к НФ, чем компонент А. Тогда компонент Б прочнее удерживается неподвижной фазой, т.е. находится более длительное время в НФ, чем компонент А. По­этому компонент Б перемешается вдоль НФ медленнее компонента А; по­следний «обгоняет» компонент Б. При достаточно большой длине пробега зона, содержания компонент А, отделяется от зоны, содержащей компо­нент Б. При этом многократно повторяются процессы сорбции и десорбции частиц обоих разделяемых компонентов, т.е. их обмен между ПФ и НФ.

Таким образом для проведения хроматографического анализа необходимо соблюдение следующих условий:

1) наличие ПФ и НФ;

2) многократное повторение актов сорбции и десорбция разделяемых компонентов, перемещающихся вместе с ПФ и НФ;

3) равновесие сорбция - десорбция должна устанавливаться достаточно быстро.

Одним из наиболее распространенных методов адсорбционной хроматографии является тонкослойная хромотография — разновидность плоскостной хроматографии, при которой адсорбент ис­пользуют в виде тонкого слоя на пластинке.

На чистую плоскую поверхность (пластинку из стекла, металла, пластмасса) тем или иным способом наносят тонкий слой сорбента, который чаще всего закрепляет­ся на поверхности пластинки. Размеры пластинки могут быть различными. На по­верхность пластинки осторожно, чтобы не повредить слой сорбента, на­мечают (например, карандашом) начало старта (на расстоянии 2—3 см. от нижнего края пластинки) линию финиша растворителя.

На линию старта пластинки наносят пробу — небольшое количество жидкости, содержащей смесь разделяе­мых веществ, например двух веществ А и В в подходящем растворителе. Дают возможность испариться растворителю, после чего пла­стинку погружают в хроматографической камере в жидкую фазу ПФ, представляющею собой специально подобранный для данного случая растворитель или смесь растворителей. Под действием капиллярных сил ПФ самопроизвольно перемещается вдали НФ от стартовой линии до линии фронта растворителя, увлекая за собой компоненты А и В пробы, которые перемещаются с разной скоростью. В рассматриваемом случае сродство компонента А к НФ меньше сродства к той же фазе компонента В, поэтому компонент А перемещается быстрее компонента В. По­сле достижения за время t подвижной фазой (растворителем) линии фронта растворителя, хроматографирование прерывают, пластинку извлекают из хроматографической камеры, высушивают на воздухе и определяют положение пятен веществ А и В на поверхности пластинки. Пятна (зоны) обычно имеют овальную или круглую форму (рис 6).

Рисунок 6 - Схема разделения компонентов А и В методом ТСХ

Для характеристики разделяемых компонентов в системе вводят коэффициент подвижности. Коэффициент подвижности является важной характеристикой сис­темы сорбент-сорбат. Коэффициент подвижности зависит от целого ряда факторов: природы и качества растворителя, его чистоты; природы и качества сорбента (тонкого слоя), техники эксперимента (массы образца, длины пробега растворителя) и т. д.

Для более надежной идентификации разделяемых компонентов используются «свидетели» — эталонные вещества, наличие которых предполагается в анализируемой пробе.

Важнейшей характе­ристикой сорбента является его активность, т. е. способность сорбировать (удержи­вать) компоненты разделяемой смеси. Активность сорбента зависит от природы активных центров и их концентрации на поверхности сорбента, от степе­ни диспертности частиц сорбента, от размеров поверхности сорбента и содержания в нем воды, от природы ПФ, взаимодействующей с сорбентом. Чем больше воды содержит сорбент, тем меньше его активность, поскольку молекулы воды, связываясь с активными центрами сорбента. В качестве сорбентов чаще всего применяют диоксид кремния — силикагель и оксид алюминия.

С помощью метода ТСХ можно не только открывать, но и количественно определять содержание компонентов в смесях. Для этого либо анализируют сами пятна на хроматограмме, либо извлекают разделенные компоненты из хроматограммы тем или иным способом (экстракцией, элюированием подходящими растворителями).

При анализе пятен предполагают существование определенной связи между площадью пятна и содержанием данного вещества (например, наличие пропорциональной или линейной зависимости), которую устанав­ливают методом построения градуированного графика, измеряя площади пятен «свидетелей» — эталонов с известным содержанием анализируе­мого компонента.

Иногда сравнивают интенсивность окраски пятен, полагая, что ин­тенсивность окраски пятна пропорциональна количеству данного окра­шенного компонента. Для измерения интенсивности окраски применяют различные приемы.

При извлечении разделенных компонентов из хроматограммы получают раствор, содержащий данный компонент. Последний затем опреде­ляют тем или иным аналитическим методом.

Относительная ошибка количественного определения вещества ме­тодом ТСХ составляет 5—10%.

Определение концентрации пестицидов в полутвердых сырах методом тонкослойной хроматографии:

Массовую долю (Х) в мг/кг или массовую концентрацию (Х1) в мг/ пестицидов в пробе вычисляют по формулам:

или

или

А – масса пестицидов, определенная визуальным сравнением со стандартным раствором, мкг;

– масса пестицидов в стандартном растворе, мг;

- площадь пятна исследуемой пробы, ;

m – масса исследуемой пробы, г;

V – объем исследуемой пробы, ;

– площадь пятна стандартного раствора,

Определение содержания афлатоксина М1 (Х, мг/кг) в полутвердых сырах методом тонкослойной хроматографии:

– масса афлатоксина М1, обнаруженная в пятне пробы, мг;

объем хлороформа, добавленный к пробе для экстракции, ;

- объем, до которого сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, ;

К - коэффициент извлечения афлатоксина М1;

m - масса навески пробы, мг;

- объем хлороформного экстракта, взятый на анализ, ;

- объем экстракта, нанесенный на пластинку, .