Задача 16

В современной биотехнологии при создании ЛС особое место отводится генной инженерии, суть технологии которой заключается…

Вариант ответа

Цели генной инженерии — создание новых продуцентов целевых продуктов (новые ЛС, диагностические и профилактические пре­параты).

Суть технологии — соединение фрагментов ДНК in vitro с последу­ющим введением изолированной ДНК в живую клетку посредством ферментов эндонуклеаз, в частности рестриктаз.

Техника генно-инженерного эксперимента.

• Получение чужеродного фрагмента ДНК для последующей встав­ки его в клетку хозяина.

• Выделение плазм иды из клетки-донора (например, Е. coli).

• Конструирование рекомбинантной плазмиды (вектора). Вектор-рекомбинант (плазм ида в виде фага или изолированной ДНК, или вируса) получают с помощью фермента рестриктазы, раз­резающей фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклеотидной цепи (сайт узна­вания). При этом образуется два липких конца. Далее следует стадия отжига — процесс смещения двух фрагментов ДНК, при котором восстанавливаются только водородные связи. Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ферменты ДНК-лигазы, которые «сшивают, склеивают» молекулы ДНК.

• Включение вектора в клетку хозяина. Вектор включается в клетку хозяина при условии, если цитоплазматическая мембрана близ­ко подходит к клеточной стенке, тогда вектор проникает внутрь клетки через так называемые окошечки, которые образуются при обработке ее ферментами, в результате чего эта клетка становится компетентной.

• Отбор гибридных клонов. Проводят посев на питательную среду, содержащую, например, антибиотик бензилпенициллин. При этом вырастают только клоны, имеющие в своем геноме ген-маркер, кодирующий синтез, например, фермента β-лактамазы. Ген-маркер заранее внедряется в геном гибридной плазмиды. В процессе образования молекулы мРНК имеет место процесс сплайсинга (сращивания). У эукариот, в отличие от прокариот, ген представляет собой мозаичную структуру, содержащую наряду с экзонами (последовательности оснований, несущие информацию) интроны (последовательности оснований, не несущие информацию). Однако фермент РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга у эукариот интроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интро­нов сращиваются. При этом образуется функционирующая (зрелая) мРНК. У прокариот нет такого процесса (так как их гены не содер­жат интроны), и образующаяся в результате транскрипции молекула мРНК сразу же способна к функционированию.

Задача 17

Возникновение таких новых дисциплин, как геномика и протео-мика, является настоящим прорывом в биологии и имеет большое…

Вариант ответа

Согласно целям и задачам различают структурную, сравнительную и функциональную геномику. Структурная геномика занимается иден­тификацией геномов клеток и отдельных структурных генов по опреде­ленным характеристикам: общее количество генов в геноме и их после­довательность, молекулярная масса, нуклеотидная последовательность в каждом гене. Эти характеристики относятся к геному-хромосоме у прокариот и к каждой из хромосом у эукариот. Сравнительная гено­мика получает сведения о степени гомологии родственных генов, что позволяет ответить на вопрос об эволюционной близости одного орга­низма другому. Она также позволяет вести поиск ингибиторов какого-либо гена (вернее, кодируемого им белкового продукта) у патогенного микроорганизма с целью создания на их основе ЛС, однако при этом необходимо знать, есть ли ген с такой или близкой последовательно­стью нуклеотидов в организме хозяина. Таким путем можно определять также степень безопасности ЛС. Функциональная или метаболическая геномика устанавливает связь между геномом и метаболизмом, кла­стерами генов и многоступенчатыми метаболическими процессами, отдельными генами и конкретными метаболическими реакциями (в этом случае имеются свои специализированные базы данных).

Практическим применением достижений геномики является генотерапия. Для реализации возможностей генотерапии требуется предварительное создание рекомбинантной генетической конструк­ции с нормальной копией дефектного гена, а также создания для этой конструкции вектора, переносящего ее в клетки организма пациента. Векторы строятся на основе ретровирусов или аденовирусов и их генетических модификаций с тем условием, чтобы при сохранении способности проникать в клетку они теряли бы способность к авто­номной репликации. Современная генотерапия направлена только на соматические клетки. Генотерапия ex vivo предполагает введение путем трансфузии или трансплантации исправленных копий дефект­ного гена, предварительно извлеченных из клеток организма пациен­та. В этом случае снимается проблема отторжения клеток и необходи­мость проведения терапии иммуносупрессорами. При генотерапии in vivo осуществляется доставка в ткани пациента нормального, но выделенного из клеток другого организма гена (чужеродного).

Антисмысловые олигонуклеотиды — ЛС XXI века, представляющие собой комплементарную для определенного участка гена последо­вательность нуклеотидов (длиной 15-20 нуклеотидов), которая за счет водородных связей будет реагировать или с ДНК гена, или с его иРНК, матрицей для которой служит вышеуказанная ДНК. Такие ЛС могут использоваться в случае гиперпродукции нормального функ­ционально активного белка, что является причиной некоторых как наследственных, так и ненаследственных заболеваний.

Подавление образования избыточного белка в случае применения антисмысловых олигонуклеотидов будет происходить либо на стадии транскрипции (реакция с ДНК), либо на стадии трансляции (реак­ция с иРНК). В качестве защиты от эндонуклеаз клетки предлагают «упаковку» таких нуклеотидов в липосомы.