Проведення плр

ПЛР – експериментальний метод молекулярної біології, призначений для збільшення концентрації певних фрагментів ДНК - збудників інфекційних захворювань, що знаходяться у крові.

ПЛР була відкрита у 1983 р.

ПЛР заснований на багаторазовому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою Таg – полімерази. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки ДНК, яка є характерною для даного мікроорганізму.

За допомогою реакції ампліфікуються короткі ділянки ДНК, які можна використати для кінцевого аналізу ідентифікації мікроорганізму.Для проведення реакції ПЛР необхідно:1Фрагмент ДНК таких клітин, які треба розмножити;2)2 праймери, комплементарні кінцям фрагменту ДНК;3)Термостабільна Таg – полімер аза;4)Дезоксинуклеотидтрифосфат

Реакція ампліфікації приводять в приладі(ампліфікатор), який забезпечує періодичну зміну температури для пробірок з реакційною сумішю.

Хід реакції1)Дволанцюгова ДНК – матриця нагрівається до 94 - 96 на 5,10 хв. Це стадія денатурації.2)Зниження темп. Відпал (на цій стадії коли ланцюги розійшлися , праймери зв’язуються з певною точкою матриці . Температура на 4 менша від попередньої 3)Реплікація ланцюжка ДНК виділеного праймером – це елонгація проводять при темпер. 72 С. Швидк. 1000 пар основ за хв.

Ідентифікація – Для аналізу БЛР ампліфікованої ДНК використовують гель – електрофорез.

Гель –електрофорез – дозволяє застосування радіоізотопів, або інших маркерів знайти ампліфікований ДНК , яку вносять в лунки агарозного об’єму. Пластинку гелю вміщують в апарат для горизонтального гель – електрофорезу і підключають постійну напругу. Фрагменти ДНК рух від – до +, при чому більш короткі фрагменти рух. швидше. Молекули різного розміру рух. з різними швидкостями після закінчення електрофорезу 20 – 60 хв., гель зафарбовують спеціальними барвниками або поміщають в ультрафіолетове світло для ідентифікації.