14. Рост и размножение микроорганизмов. Методы контроля и изменения количества клеток и биомассы растущей культуры.

Рост – увеличение массы клетки. О росте судят по изменению кол-ва клеток или биомассы в процессе культивирования, это основано на способности МО размножаться. Размножение – увеличение числа особей в микробной популяции. Оно происходит у прокариот с помощью бинарного поперечного деления клетки(образуется 2 дочерних, старая умирает): путем синтеза поперечно перегородки от периферии к центру, перетяжки, почкования либо множественного деления(байеоциты выходят из материнской клетки при разрыве ее клет. стенки, роста нет, они снова делятся). Бинарное деление происходит в одной или нескольких плоскостях. Если клетки не расходятся – образуются цепочки, палочки или клеточные скопления. Расхождение в результат лизиса клеточной стенки. Общее число клеток определяется: под микроскопом в тонком слое определенного объема с помощью счетной камеры(применяют электронный счетчик, подвижные клетки убивают нагреванием); в капиллярах Перфильева(на предм. стекле заливают концы парафином); визуальным сравнением с помощью стандарта мутности(взвесь частиц стекла в дист. воде, за единицу мутности принята мутность суспензии живых клеток возбудителей тифа в физ. растворе, содержащих в 1 мл. 100 млн. клеток, используют 18 – 48 часовые культуры); в окрашенных мазках(Виноградского – Брида); путем подсчета колоний, выросших на ППС в чашках Петри( чашечный метод Коха). Определение бактериальной массы: «сырую» массу определяют после осаждения клеток центрифугированием; определение общего азота; содержание бактериального белка; измерение количества света, рассеянного суспензией клеток – с помощью спектрофотометра или нефелометра(прибор показывает единицы оптической плотности – отношение интенсивности света, падающего на суспензию к интенсивности пропускания света), сравнение со стандартной кривой.

15. Разнообразие типов питания микроорганизмов. Классификация микроорганизмов по типам питания.

2 основных типа питания: автотрофный( неорганич. вещества), гетеротрофный( органич. вещества, аблигатные внутриклеточные организмы). Способные расти на ПС вне клетки хозяина – факультативные паразиты. Сапрофиты – не зависят от других организмов, но питаются органикой( разлагающимися останками); обязательнее элементы их питания – углеводы, пептиды, витамины(культивируют на мясных гидролизатах). Олиготрофы – низкая концентрация питательных веществ, копиотрофы – высокая концентрация питательных веществ. В зависимости от источника энергии: фототрофы (свет), хемотрофы( окислительно-восстановительные реакции), литотрофы( доноры электронов – норг. вещества), органотрофы(доноры электронов – органические вещества). 4 типа энергетического метаболизма: фотолитотрофия, фотоорганотрофия ,хемолитотрофия, хемоорганотрофия. Большинство прокариот – хемоорганогетеротрофы. Цианобактерии - аблигатные фотолитоавтотрофы ( только солнечная энергия и углекислый газ). Фотоавтотрофы( свет и углекислый газ, фотосинтетические организмы). Фотогетеротрофы( свет и ораническое вещество, зеленые бактерии). Хемоавтотрофы(химический истоник энергии и углекислый газ, бактерии, растущие в минеральной среде без света). Хемогетеротрофы(химический источник энергии и органическое вещество). Прототрофы – 1 источник энергии, ауксотрофы – более одного источника энергии.

16. Типы микробных культур. Периодическое культивирование.

17. Кривая роста микробных культур, особенности отдельных фаз и определение параметров роста.

Чаще используется на практике. Питательные вещества возобновляются, поэтому экспоненциальный рост клеток сохраняется только в течение нескольких генераций. Ферментер на 0,5 – 0,7 объема заполняют ПС, вносят посевной материал. Изменяются при культивировании: скорость роста, физиолого-морфологические, биохимические показатели, состав ПС( поглощение питат. веществ и выделение продуктов метаболизма). Кривая роста культуры в реакторе периодического действия (логарифм числа клеток / время):

1) лог – фаза (задержка роста, численность популяции не изменяется, адаптация к среде); 2) фаза экспоненциального роста(быстрый рост, характеризуется постоянной max-ной скоростью деления клеток, зависящй от вида бактерий и среды); 3) стационарная фаза(число клеток достигает max-ма, перестает увеличиваться, скорость роста зависит от концентрации субстрата); 4) фаза отмирания( число клеток плавно начинает снижаться, гибнут). Выход биомассы – количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, зависит от условий культивирования. Параметры кривой роста: выход клеток(урожай)(разность между max и исходной массой бактерий), скорость экспоненциального роста( мера скорости клеток, вычисляют отношение плотности ко времени), длительность логарифмической фазы(позволяет судить о свойствах бактерий и о пригодности среды, это промежуток времени между моментом, в который культура должна достигнуть оптимальной плотности и моментом, в который оно могла бы достичь такой плотности, если бы сразу после инокуляции начался экспоненциальный рост).

Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую си­стему, которая в своем развитии проходит четыре фазы-начальную, экспоненциаль­ную, стационарную и фазу отмирания. Условия существования культуры во всех этих фазах раз­личны. Автоматическое регулирование в периодической культуре вряд ли возможно.

18. Концентрирование микробных культур. Осаждение, сепарирование, центрифугирование, флотация, фильтрация.

По завершению  процесса культивирования биомасса микробных клеток в биореакторе  находится в виде суспензии или раствора при этом характерно наличие многих примесных компонентов.

В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости идет разделение массы клеток микроорганизмов от жидкостной фазы – сепарация. Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал) возможно и методом фильтрации. Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуетсям2 фракции: биомассам(твердая) и культуральная жидкость.

Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.

Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы:

·     экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация, если целевой продукт в растворе;

·     осаживание, фильтрование, центрифугирование, сепарирование, если целевой продукт в виде твердой фазы.

Часто применяют комбинацию нескольких мето­дов. Как правило, при вы­делении растворенных веществ культуральную жидкость при­ходится подвергать предварительной обработке и очистке с по­мощью осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепа­рирования и мембранных методов (электродиализ, ультра- и микрофильтрация).

 1 Осаждение (седиментация) - это процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде осадка.

Скорость осаживания биомассы из культуральной жидкости невелика и составляет порядка 10⁶-10⁷ м/с. Для ускорения процесса осаждения применяют:

· коагулянты - вещества, переводящие взвешивание частиц в агрегатно-неустойчивое состояние, например, желатин, рыб­ный клей, казеин;

· флокулянты - вещества, способствующие разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев это, например, метилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия.

2 Центрифугирование - это разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил.

Для центрифугирования применяют центрифуги различных конструкций.

Центрифуги, которые осна­щены тарельчатыми барабанами, называются сепараторами. В микробиологической промышленностирсепараторы являются одним изрсамых распространенных типов центрифугои позволяют сконцентрироватьоосадок до содержания влажности около 60-90%.

3 Фильтрация - это разделение твердой и жидкой фаз сус­пензии при пропускании ее через пористую перегородку.

Это гидродинамический процесс, скорость ко­торого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки и обратно про­порциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.

4 Сепарация - процесс разделения смешанных объёмов разнородных частиц жидкостей разной плотности, эмульсий, твёрдых материалов, взвесей твёрдых частиц или капелек в газе. При сепарации не происходит изменения химического состава разделяемых веществ. Сепарация возможна если присутствуют различия в характеристиках компонентов в смеси: в размерах твёрдых частиц, в их массах, в форме, плотности и других.

Свойства, отличающие продукты сепарации, не обязательно должны совпадать с признаками, по которым разделяют смесь компонентов в производстве. В самом процессе сепарации принимает участие очень большое количество отдельных мелких частиц, среди которых встречаются частицы с промежуточными свойствами по отношению к необходимыми признаками. Из исходной смеси после сепарации не могут получиться абсолютно чистые фракции разделяемых компонентов, а лишь продукты с преобладающим их содержанием.

Выбор способа сепарации зависит от процентного состава и свойств разделяемой смеси и составляющих её компонентов, степени соответствия желаемых свойств получаемых продуктов от последствий разделения и свойств компонентов. Сепарация, как правило, происходит не только по главному признаку, который отличает компоненты в смеси, а по целому ряду свойств. Процессы сепарации различаются от внешних условий и аппарата, в котором происходит разделение. В современном производстве для различных целей и смесей применяется разнообразные способы сепарации.

·  сепарация по массе (инерционная)

·  размеру

·  упругости

·  трению

·  воздушная сепарация

·  электрическая

·  магнитная

·  пенная

·  радиометрическая