Полимеразная цепная реакция – пцр.

В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирубонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК.

Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии (рис.2). Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксированно искусственно синтезированным праймером.

Рис. 1. ПЦР: Полимеразная Цепная Реакция

Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования.

Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом элетрофореза в геле.

In Situ ПЦР

Метод In Situ (IS)- ПЦР стал активно развиваться в последнее время благодаря тому, что он, в отличие от ПЦР, проводимой в растворе, позволяет не только специфически амплифицировать какую-либо последовательность ДНК, но и локализовать ее внутри клетки.

Рисунок 1. Метод характеризуется такой же высокой чувствительностью, как и ПЦР, проводимая в растворе (возможность амплификации исходно одной копии ДНК-мишени). Способность локализовать специфическую последовательность делает IS-ПЦР неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффекта действия новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровне.

Рисунок 2.

Внутриклеточное обнаружение продуктов ПЦР может осуществляться двумя способами: через опосредованную (непрямую) In Situ гибридизацию или прямую детекцию меченых нуклеотидов (например, дигоксигенин-11-дУТФ, флуоресцеин-дУТФ), которые включаются в состав амплифицируемого продукта в процессе ПЦР (прямая IS-ПЦР) (рис.1). В непрямом методе гибридизация меченой ДНК-пробы с амплифицированным продуктом обеспечивает максимальную специфичность при внутриклеточной детекции ПЦР-продуктов. Существует ряд некоторых особенностей проведения IS ПЦР. В первую очередь это касается протеолитической обработки гистологических срезов или клеточного монослоя. Высокая концентрация протеолитических ферментов (трипсин, пепсин или протеиназа К), или длительное время инкубации с ними часто приводят к искажению морфологической картины препарата, а низкие концентрации - к недостаточному протеолизу и, как следствие этого, к низкой проницаемости клеточной мембраны для ПЦР. При проведении IS-ПЦР также учитывается возможность получения как ложно-положительных, так и ложноотрицательных результатов. Первая группа артефактов включает в себя амплификацию неспецифической ДНК в результате ПЦР, неспецифическое включение меченого нуклеотида вследствие репаративных свойств ДНК-полимеразы клетки или используемой в реакции Taq-полимеразы, диффузию амплифицированных фрагментов ДНК из клеток. Вторая группа артефактов (ложноотрицательные результаты) особенно характерна для IS-ПЦР, выполненной на стекле. Их причина до конца не выяснена, но возможно уменьшение эффективности амплификации обусловлено физическими факторами, такими как недостаточно быстрое охлаждение и нагревание препарата, недостаточная конвекция реагентов под зажимами или возможная адсорбция ДНК-полимеразы и других компонентов на поверхности стекла, покрытой специальным агентом. Альтернативное объяснение ложно-отрицательных результатов - это потеря ПЦР-продуктов во время промывок препарата при детекции. Чтобы избежать ложноотрицательных и ложноположительных результатов обычно выполняют следующие контроли: обработка срезов или клеточного монослоя ДНК-азой (отрицательный контроль), проведение амплификации ДНК без ДНК-полимеразы; проведение амплификации ДНК без праймеров (контроль ДНК-полимеразной репарации), проведение процедуры выявления без использования антител, а также без использования щелочной фосфатазы - для регистрации содержания эндогенного биотина и эндогенной активности фермента (если в качестве меченого нуклеотида используется биотин -11-дУТФ).