3. Трактовка результатов

В ходе вышеописанного исследования определяют три вида антител:

нормальные полные антитела - агглютинины a и b (термолабильные);

иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные);

иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные).

Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований:

наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместимого по АВО системе. Титр полных (термолабильных) антител a и b редко превышает такие показатели, как 1:8 - для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных антител;

высокий титр нормальных полных антител - агглютининов a и b ( выше, чем 1:256 и  выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВО;

отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител  не выше, чем 1:256 и  не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации группо­выми факторами системы АВО к моменту данного исследования.

V. Выявление иммунных (IgG) анти-а, анти-в антител

с использованием унитиола

Характеристика метода

Выявление IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВО затруднено из-за одновременного присутствия в сыворотке естественных изогемагглютининов, относящихся к классу IgМ. В данном методе иммунные IgG анти-А, анти-В антитела выявляются после полного разрушения унитиолом естественных IgМ антител системы антигенов эритроцитов АВО.

Для инактивации IgМ используют сульфидредуцент, разрушающий дисульфидные связи в молекулах иммуноглобулинов, 5% раствор унитиола (2,3-димеркаптопропансульфонат Nа). Выявление IgG анти-А, анти-В затем проводится прямой агглютинацией с эритроцитами А и В при комнатной температуре.

Метод пригоден для дифференциальной диагностики IgG и IgМ антител к антигенам эритроцитов любой специфичности в сыворотке крови человека, молоке, а также моноклональных антителах.

Оборудование и реактивы

5% раствор унитиола.

Моноклональные антитела анти-D супер IgМ.

Стандартные эритроциты групп крови А, В, а также эритроциты О (I) резус-положительной принадлежности.

Раствор NaCI 0,9%.

Термостат лабораторный на +37С.

Планшеты с белой смачиваемой поверхностью.

Пробирки вместимостью 5-10 мл.

Пипетки.

Штативы.

Палочки аппликаторы.

Часы (секундомер).

Перчатки резиновые хирургические.

Порядок проведения исследования

Для приготовления рабочего раствора 2,5% унитиола используют 5% раствор унитиола (готовая лекарственная форма), который разводят раствором NaCI 0,9% в соотношении 1:1.

В сухой чистой пробирке смешать равные объемы исследуемой сыворотки и 2,5% раствора унитиола – опыт.

Во второй пробирке смешать равные объемы моноклональных антител анти-D супер IgМ и 2,5% раствора унитиола – контроль.

Все пробирки инкубировать 24 часа при комнатной температуре (не ниже 16С) или в термостате при +37С в течение двух часов. При использовании для разрушения IgМ антител 5% раствора унитиола инкубацию сывороток в термостате сокращают до 1 часа.

Сыворотки после обработки раствором унитиола исследуют в тесте прямой агглютинации с эритроцитами А и/или В в условиях, аналогичных исследованию естественных изогемаггютининов на плоскости без подогрева или в пробирках с использованием центрифугирования.

Для контроля используют эритроциты группы крови О(I) резус-положительной принадлежности.

Интерпретация результатов

Сыворотки, инкубированные с раствором унитиола и сохранившие способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В, содержат анти-А или анти-В антитела класса IgG – положительный результат.

Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце IgG антител к антигенам эритроцитов, при этом сыворотки утрачивают способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В.

Результат в контрольной пробе должен быть всегда отрицательным, что свидетельствует о разрушении антител класса IgМ в моноклональных антителах анти-D и эффективности действия унитиола.

Для установления титра IgG антител производят последовательное разведение сывороток, бывших в контакте с унитиолом. За титр принимают величину, обратную наибольшему разведению, в котором отчетливо видна агглютинация со стандартными эритроцитами групп А и/или В. Время наблюдения за реакцией – 5 минут при проведении исследования на плоскости без подогрева.

Условия хранения и эксплуатации

Срок хранения вскрытой ампулы 5% раствора унитиола не должен превышать 5 дней при хранении в холодильнике (t +28С).

VI. Определение гемолизинов системы АВО

Оснащение

Стандартные эритроциты группы 0(I), А (II) и В(III).

Изотонический раствор NaCI.

Пробирки вместимостью 8-10 мл.

Маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см.

Штативы.

Термостат +37⁰С.

Центрифуга.

Подготовительная работа

Стандартные эритроциты групп 0(I), А(II) и B(III), а также эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоническим раствором NaCI путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь в изотоническом растворе NaCI.

Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не более 48 часов при температуре +4 - +8^OС.

В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью 8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом растворе NaCI, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.

Техника реакции

В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда  при исследовании сыворотки группы 0(I). Пробирки нумеруют одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с исходными разведениями сыворотки.

Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 -1:32).

Исследуемую сыворотку из исходных разведении переносят соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых  1:4 и т. д. до 1:32.

Затем во все пробирки добавляют по одной капле 5% взвеси эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты лица, сыворотка которого исследуется; во второй (также контрольный) ряд  эритроциты группы 0(I); в третий ряд вводят эритроциты противоположной группы, т. е. группы В(III), если исследуется сыворотка группы А(II) или группы А(II), если исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки группы 0(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в четвертый ряд - эритроциты группы В(III).

Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и штатив помещают в термостат на 45 минут при температуре +37°С, затем пробирки вынимают из термостата и просматривают результат реакции невооруженным глазом в проходящем свете.

Трактовка результатов определения групповых гемолизинов

В ходе исследования определяется наличие или отсутствие групповых гемолизинов анти-А и анти-В.

Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности окрашивания надосадочной жидкости:

если эритроциты полностью сохранились в осадке, а надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, что групповые гемолизины отсутствуют (обозначают знаком минус (-);

если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочная жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности (иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов)  это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от одного плюса (+) до трех плюсов (+++);

если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой сыворотке со­держатся групповые гемолизины, что оценивается на четыре плюса (++++);

наличие гемолиза эритроцитов свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке гемолизинов, а максимальное разведение, в котором он наблюдается  об их активности (титре). В том случае, если гемолиз эритроцитов произошел во всех пробирках, исследование следует повторить, продолжив разведение сыворотки, для установления конечного разведения, в котором еще наблюдается гемолиз.

Результаты учитывают как истинные, т.е. относящиеся к гемолизинам анти-А и анти-В, только при отсутствии гемолиза в двух контрольных рядах.

При наличии гемолиза не только с эритроцитами противоположной группы, но и в контрольных рядах - исследование повторяют. При подтверждении результатов реакции следует решать вопрос о природе обнаруженных гемолизинов с учетом характера заболевания и других показателей.