Классификация микроорганизмов и методы изучения их морфологии

МОРФОЛОГИЯ И СИСТЕМАТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель занятия: ознакомить учащихся с системати­кой микроорганизмов и морфологией бактерий.

Систематика микроорганизмов

Микроорганизмы - это мельчайшие, невидимые не­вооруженным глазом существа растительного и животно­го мира Земли. К микроорганизмам относят:

1. Бактерии - микроорганизмы растительного проис­хождения. Их размер колеблется в пределах 0,15-40 микрон (мк);

2. риккетсии - микроорганизмы, занимающие проме­жуточное положение между бактериями и вирусами. Размер их 0,3-0,4 мк;

3. вирусы - особые инфекционные агенты, относящие­ся к наиболее простым формам жизни, не имеющие кле­точного строения. Размер их 10-450 ммк;

4. спирохеты - микроорганизмы, занимающие про­межуточное положение между бактериями и простейши­ми. Их размер 7-500x1,5 мк;

5. простейшие - одноклеточные микроорганизмы жи­вотного происхождения;

6. грибы - микроорганизмы растительного происхождения разнообразной формы.

Размеры микроорганизмов чрезвычайно малы. Поэто­му выявление и изучение их возможно только при помо­щи специальных оптических приборов - микроскопов.

Контрольные вопросы

1. Назовите основных представителей микроорганизмов.

2. Назовите микроорганизмы растительного мира.

3. Назовите микроорганизмы животного мира.

4. Назовите микроорганизмы, занимающие промежуточное поло­жение.

5. При помощи каких приборов возможно изучение микроорганизмов?

3адание. Ознакомьтесь с учебными таблицами основных пред­ставителей мира микроорганизмов. Зарисуйте в тетради. Заполните в форме № 3 те графы, материалы для которых вы уже усвоили.

Форма № 3

Систематическое положение	Размер	Происхождение (растительное или животное)	Особенности строения бактерий
1 2 3 4 5 6

Бактерии и их основные формы

Бактерии занимают значительное место среди всего разнообразия мира микроорганизмов и являются одной из наиболее изученных групп.

По форме бактерии делят на шаровидные, палочко­видные и извитые.

Шаровидные бактерии, или кокки (от греч. коккус — ягода) могут быть сферическими, бобо­видными, ланцетовидными (т. е. закругленными с одной стороны и заостренными с другой) и эллипсоидными. В за­висимости от расположения клеток после деления кокки подразделяют на следующие группы:

• микрококки (от греч. микрос - малый) — кокки пра­вильной формы, деление и расположение после; деления беспорядочное;

• диплококки (от греч. диплос — двойной). Делятся в одной плоскости, после деления располагаются попарно. Могут быть бобовидной, ланцетовидной и круглой формы;

• стрептококки (от греч. стрептос—цепочка). Делятся в одной плоскости, образуя цепочки. Отдельные виды вы­зывают гнойные заболевания;

• стафилококки (от греч. стафиле — виноградная гроздь). Делятся в нескольких плоскостях, располагают­ся в виде виноградной грозди. Отдельные представители вызывают гнойные заболевания;

• тетракокки (от греч. тетра — четыре). Делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, располагаются по четыре;

• сарцины (от лат. сарцио — связываю). Делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, располагаются в виде тюков или пакетов по 8 или 16 кокков.

Контрольные вопросы

1. Назовите возможные размеры бактериальных клеток.

2. Какие формы бактерий Вы знаете?

3. Почему шаровидные бактерии называют кокками?

4. Назовите формы кокков.

5. Что служит основанием для деления кокков на группы?

6. Перечислите основные группы кокков.

7. Расскажите об особенностях деления, расположения и формы кокков.

Задание. Ознакомьтесь с рис. 1—1. Возьмите готовые препара­ты и изучите их под микроскопом при помощи иммерсионной систе­мы. Зарисуйте в тетрадь отдельных представителей группы кокков. Заполните форму № 4.

Форма № 4

Морфология бактерий	Закономерности деления	Расположение после деления	Особенности формы	Отдельные представители

Внимание! Готовые препараты являются музейными, их нельзя опускать в дезинфицирующий раствор, так как при этом они разрушаются. Мягкой фланелькой или мар­лей удалите с препаратов иммерсионное масло и верни­те преподавателю.

Палочковидные бактерии, или просто бак­терии (от греч. Бактерион - палочка), подразделяются на бактерии, не образующие спор, и бактерии, образую­щие споры. К первым относятся возбудители чумы, туля­ремии, дизентерии, брюшного тифа, коклюша и т. д. К бациллам, т. е. бактериям, образующим споры, отно­сятся возбудители сибирской язвы, газовой гангрены, столбняка, ботулизма и т. д.

Большое значение для идентификации бактерий имеют их расположение и особенности формы. Бактерии, кото­рые располагаются попарно, называют диплобактериями. Если диплобактерии образуют споры, их называют диплобациллами. Бактерии, располагающиеся цепочкой, на­зывают стрептобактериями. При образовании стрептобактериями спор их называют стрептобациллами.

По форме различают, палочки яйцевидной формы с заостренными концами (возбудители чумы); палочки с обрубленными концами (возбудители сибирской язвы); палочки цилиндрической формы с закругленными краями (возбудители дизентерии, брюшного тифа); палочки, по форме приближающиеся к коккам (возбудители кок­люша).

Контрольные вопросы

1. На какие две группы подразделяются палочковидные бактерии и по какому признаку?

2. Назовите отдельных представителей бактерий, не образующих спор.

3. Назовите отдельных представителей бактерий, образующих споры.

4. Как называются бактерии, которые располагаются попарно и не образуют спор?

5. Как называются бактерии, располагающиеся цепочкой:

а) образующие споры;

б) не образующие споры?

6.Расскажите об особенностях форм бактерий.

Задание. Возьмите готовые препараты палочковидных бакте­рий и изучите их под микроскопом при помощи иммерсионной сис­темы.

Ознакомьтесь с рис. 1—II.

Зарисуйте в тетрадь отдельных представителей палочковидных

бактерий.

Извитые бактерии представлены вибрионами и спириллами. Вибрионы - формы, имеющие вид запя­той (1/4 оборота спирали). Характерным представителем этой группы является возбудитель-азиатской холеры — холерный вибрион.

Спириллы — формы бактерий, имеющие от одного до нескольких завитков. Представители этой группы обычно не вызывают заболеваний у человека. Исключение пред­ставляет возбудитель содоку.

Контрольные вопросы

1. На какие две группы делятся представители извитых бактерий?

2. Расскажите о морфологии вибрионов и спирилл.

Задание. Возьмите готовые препараты извитых бактерий и изу­чите их под микроскопом при помощи иммерсионной системы.

Ознакомьтесь с рис. 1—III.

Зарисуйте в тетрадь рассмотренные препараты.

Внимание! После окончания занятий не забудьте вы­ключить осветители, протереть объективы и поставить ми­кроскопы на место.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МОРФОЛОГИИ МИКРООРГАНИМОВ

С помощью микроскопа микробы изучают в окрашен­ном и неокрашенном виде. Но, прежде чем готовить пре­параты, необходимо отметить, что от качества приготов­ления препарата зависит результат исследования под микроскопом.

Обработка предметных и покровных стекол

Для работы необходимо иметь специально приготов­ленные предметные и покровные стекла. Стекла должны быть чистыми и обезжиренными. Для обезжиривания стекла помещают в сосуды с притертой пробкой, в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96° спирт. Перед работой необработанные стекла можно обезжирить следующим образом: рабочую поверхность стекла натереть мылом, которое затем удалить чистой сухой тканью.

Внимание! Из обезжиривающих растворов стекла извлекают пинцетом. При работе стекла держат пальцами за ребро.

Материалом для исследования мо­гут служить испражнения, гной, мокро­та, кровь, рвотные массы и т. д., а так­же культуры микроорганизмов, вырос­шие на плотных и жидких питательных средах.

В зависимости от характера иссле­дуемого материала при заборе исполь­зуют бактериологическую петлю, пас­теровскую пипетку или иглу. Петлю делают из платиновой или нихромовой (сплав хрома с никелем) нити длиной 5-6 см, закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде плот­но замкнутой петли размером 1X1,5 или 2Х3 мм (рис. 2). Петлю держат как карандаш. Рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в верти­кальном положении, сначала конец петли, затем посте­пенно всю металлическую часть.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде

Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламе­ни горелки. На охлажденное предметное стекло, положен­ное на рабочий стол, петлей наносят каплю физиологи­ческого раствора. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой ру­ки. Бактериологическую петлю берут правой рукой и прожигают ее в пламени горелки. Не выпуская петли из правой руки, мизинцем прижимают пробку к ладони и спокойно вынимают из пробирки. Движения не должны быть резкими и размашистыми. Во время манипуляции с пробиркой пробка находится в руке. Прожигают пробку и горло пробирки в пламени горелки. Вводят петлю в про­бирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки, чтобы го­рячая петля не убила выросшую культуру. Захватывают петлей культуру и выводят ее из пробирки, не касаясь стенок. Держа петлю с культурой, закрывают пробирку пробкой над пламенем горелки. Ставят пробирку в шта­тив. Петлю с культурой опускают на стекло и растирают материал рядом с каплей физиологического раствора, а затем постепенно эмульгируют в физиологическом рас­творе. Остатки культуры на петле сжигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть тонким, равномерно растертым и небольшим.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде

Каплю культуры наносят на обезжиренное стекло пет­лей или пастеровской пипеткой, соблюдая описанный вы­ше порядок работы.

Внимание! Пипетку после работы помещают в дезин­фицирующий раствор, всегда находящийся на рабочем месте лаборанта.

Мазок оставляют для высыхания.

Приготовление мазка из гноя или мокроты

Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Затем вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы оста­лись свободными треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два отдельных боль­ших мазка.

Приготовление мазков из крови

Каплю крови наносят на границу между левой и сред­ней третью предметного стекла. Затем краем второго спе­циально отшлифованного стекла прикасаются к капле крови, располагая стекло под углом в 45°. Прижимая отшлифованное стекло к предметному, продвигают его. Хорошо сделанный мазок имеет желтоватый цвет и про­свечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции

Раскаленным скальпелем прижигают поверхность ор­гана или пищевого продукта и из этого участка вырезают кусочек материала. Разрезанной поверхностью прикаса­ются к стеклу в 2-3 местах.

Высушивание мазка

Мазки высушивают на воздухе при комнатной темпе­ратуре или в термостате. В случае необходимости можно высушить их над пламенем горелки, держа стекло за края большим и указательным пальцами мазком вверх. Средний палец помещают под стекло, чтобы контролиро­вать степень нагревания.

Внимание! При высокой температуре может произой­ти нарушение структуры клеток.

Фиксация мазка

Мазки фиксируют после полного высыхания с целью:

1. закрепить микробы на стекле;

2. обезвредить культуру;

3. убитые микробы лучше воспринимают окраску.

Способы фиксации мазков

1. В пламени горелки мазки фиксируют следующим образом: стекло берут большим и указательным пальцами или пинцетом и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки (6 секунд).

2. Фиксация в жидкости: клеточные элементы в маз­ках из крови и в мазках-отпечатках при действии высо­ких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают фиксирующей жидкостью:

а) метиловым спиртом - 5 минут;

б) этиловым спиртом - 10 минут;

в) смесью Никифорова – 10-15 минут;

г) ацетоном - 5 минут;

д) парами кислоты и формалина — несколько секунд.

Контрольные вопросы

1. Расскажите о методах исследования под микроскопом.

2. Как обрабатывают предметные и покровные стекла?

3. Как приготовить бактериологическую петлю?

4. Что может служить материалом для исследования?

5. Из каких этапов складывается процесс приготовления мазка?

6. Как приготовить мазок из культуры, выращенной на плотной питательной среде; жидкой питательной среде; из гноя; крови; внут­ренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции?

7. С какой целью и как высушивают мазки?

8. С какой целью и как фиксируют мазки?

Задание. Приготовьте бактериологическую петлю. Приготовь­те мазки из культуры, выращенной на жидкой и плотной питатель­ных средах. Высушите и зафиксируйте их в пламени горелки.

Окраска препаратов

Следующим этапом приготовления препарата являет­ся его окраска.

Микроорганизмы различно относятся к краскам — эти свойства называют тинкториальными. Наибо­лее широко в микробиологии используют анилиновые красители основного и кислого характера. Большинство микробов лучше воспринимает основные красители.

Для окраски мазков применяют следующие краси­тели:

1. красные (фуксин основной, фуксин кислый, нейтральный красный, конгорот);

2. синие (метиленовый и толуидиновый);

3. фиолетовые (генцианфиолетовый, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый);

3. коричнево-желтые (везувин, хризоидин);

3. зеленые (бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый).

Способы окраски можно в основном разделить на две группы: ориентировочные, или простые, и дифференци­альные: сложные, выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки. Для окраски исполь­зуют водно-феноловые и водно-спиртовые растворы, ко­торые готовят из насыщенных спиртовых и феноловых растворов красок.

Рецепты красок

1. Насыщенные спиртовые растворы:

красителя 1 г

спирта 96º 10 мл

Смесь помещают в термостат на несколько дней для полного растворения. Ежедневно смесь взбалтывают.

2. Карболовый фуксин Циля (применяют для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):

основной фуксин 1 г

спирт 96° 10 мл

фенол кристаллический 5 г

глицерин несколько капель

вода дистиллированная 100 мл

Фуксин с кристаллами фенола и несколькими капля­ми глицерина растирают в ступке до получения гомоген­ной массы, добавляя малыми порциями спирт, при поме­шивании добавляют воду. Помещают в термостат на 48 часов, затем фильтруют. Срок хранения длительный.

3. Фуксин Пфейффера используют для окраски по Граму и для простого метода окраски:

Фуксин Циля 1 мл

вода дистиллированная 9 мл

Краску готовят непосредственно перед применением.

4. Карболовый генцианфиолетовый применяют при окраске по Граму:

Генцианфиолетовый 1 г

спирт 96° 10 мл

кристаллы карболовой кислоты 2 г.

дистиллированная вода 100 мл

Растирают в ступке краситель с карболовой кислотой до получения кашицеобразной массы, прибавляют не­большими порциями спирт и разводят водой. Сливают в бутыль, помещают в термостат, фильтруют.

5. Раствор Люголя:

йодистый калий 2 г.

дистиллированная вода 10 мл

кристаллический йод 1 г

Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.

6. Щелочная синь Леффлера:

насыщенный спиртовой раствор метиленового синего 30 мл

1% раствор КОН 1 мл

дистиллированная вода 100 мл

7. Бумажки по Синеву. Полоски фильтровальной бу­маги пропитывают 1% спиртовым раствором кристалл-фиолетового и высушивают. Используют при окраске по методу Грама.

Оборудование стола для окраски

Окраску мазков производят на специально оборудо­ванном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. п. На столе держат сосуд с дистиллированной водой, емкость для слива красок, подставку из двух стеклянных трубочек или палочек, соединенных с обеих сторон рези­новыми трубками, пинцеты, цилиндры разных размеров, градуированные и глазные пипетки, фильтровальную бу­магу, набор красок, часто употребляемых в работе.

Желательно, чтобы стол для окраски находился рядом с водопроводным краном.

Простой метод окраски мазков

Зафиксированный мазок помещают на подставку для окраски исследуемым материалом вверх. Пипеткой на­носят раствор краски, чтобы покрыть весь мазок. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При этом методе используют лишь одну краску. Щелочной синью Леффлера окрашивают в течение 3-5 минут, фуксином Пфейффера 1-2 минуты.

На окрашенный препарат наносят каплю кедрового масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы. При просмотре препарата сухой системой световые лучи, идущие от зеркала в объективе, проходят через не­однородные среды. Лучи отклоняются и не попадают в объектив, что создает плохое освещение препарата. При использовании иммерсионной системы, включающей им­мерсионный объектив с увеличением 90 или 120 и кедро­вое масло, этот недостаток устраняется. Показатель пре­ломления кедрового масла такой же, как у стекла, поэто­му для световых лучей создается однородная среда.

Методы дифференциальной окраски

Одним из наиболее часто применяемых методов диф­ференциальной окраски является окраска по Граму. В зависимости от окраски по Граму все бактерии делятся на две группы. Грамположительные бактерии образуют прочное соединение с фиолетовой краской; бактерии, не воспринимающие этой краски, называются грамотрицательными.

Клеточная стенка грамположительных бактерий со­держит магниевую соль РНК, которая образует прочное комплексное соединение с йодом и синей краской (генцианфиолетовым, метилфиолетовым и т. п.). Этот комп­лекс не разрушается при воздействии спирта и бактерии сохраняют первоначальный фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не содержат магниевой соли РНК и поэтому не способны удержать фиолетовую краску. Под действием спирта они обесцвечиваются, а окрашиваются в красный цвет фуксином Пфейффера.

Окраска по Грамму

1. На фиксированный мазок накладывают полоску бумаги, приготовленную по методу Синева, и наносят не­сколько капель воды или непосредственно на мазок на­носят раствор генцианфиолетовой краски на 1—2 минуты.

2. Снимают пинцетом бумагу. Не промывая препарата водой, сливают краску и наносят раствор Люголя на ми­нуту, до полного почернения.

3. Сливают раствор Люголя, не промывая водой, погружают препарат в стаканчик с 96° спиртом на 20— 30 секунд. Обесцвечивание производят до отхождения фиолетовых струй краски.

4. Препарат тщательно промывают водой для удале­ния спирта.

5. Докрашивают препарат фуксином, Пфейффера в течение 3 минут. Краску смывают водой, препарат высу­шивают и микроскопируют при помощи иммерсионной системы.

Грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет.

Грамотрицательные микробы окрашиваются в крас­ный цвет (розовый).

В некоторых случаях окраска по Граму позволяет су­дить о характере возбудителя.

Окраска по Цилю-Нильсену

Применяют для выявления кислотоустойчивых бакте­рий туберкулеза. Для увеличения степени проницаемости бактериальной стенки препарат окрашивают фукси­ном Циля при подогревании. Окрашенные микроорганиз­мы не обесцвечиваются слабыми растворами минераль­ных кислот и спиртами. Явление кислотоустойчивости объясняется наличием в оболочке микробных клеток липидов, воска и оксикислот.

1. Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой и наливают фуксин Циля. Затем, удерживая пре­парат пинцетом, мазок подогревают в пламени горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию краски и повторяют манипуляцию 2—3 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая его 2—3 раза в раствор или наливая этот раствор на мазок, затем препарат несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3—5 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, другие формы приобретают синюю окраску.

Сложные методы окраски будут рассмотрены в раз деле, посвященном строению бактериальной клетки.

Прижизненная окраска микробов

При этом методе используют красители в большом разведении (1:10000). На предметном стекле смешивают каплю исследуемого материала с раствором краски (метиленовый синий, нейтральный красный и т. п.). Препа­раты микроскопируют с помощью объектива X 40.

Контрольные вопросы

1. Что такое тинкториальные свойства микробов?

2. Какие краски применяют в микробиологической практике?

3. Расскажите об оборудовании стола для красок.

1. Техника простого метода окраски мазков. Краски, используе­мые при этом методе.

5. Дифференциальная окраска микробов. Метод Грама.

Задание. Окрасьте зафиксированные мазки простым методом

и по методу Грама. Изучите их под микроскопом и зарисуйте в тет­радь (цветными карандашами).

Строение бактериальной клетки

Изучают строение бактериальной клетки, применяя сложные методы окраски и тончайшую оптическую тех­нику.

Обособленного ядра в бактериальной клетке нет. Оно находится в цитоплазме в рассеянном состоянии. Ядерное вещество окрашивается при использовании сложного ме­тода окраски — метода Фельгена-Шиффа — в красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма микробной клетки — в розовый.

Контрольные вопросы

1. Перечислите основные элементы бактериальной клетки.

2. Что способствует выявлению и изучению структурных элемен­тов бактериальной клетки?

3. Что представляет собой ядро бактериальной клетки?

4. В какой цвет окрашивается ядерное вещество и каким мето­дом окраски?

Задание. Ознакомьтесь с рис. 3 и зарисуйте его в тетрадь.

Цитоплазма состоит из белков, жиров, углеводов, органических соединений, минеральных веществ и воды.

Включения — скопления определенных веществ: гликогена, крахмала, жира, белка. Наличие отдельных включений имеет диагностическое значение для иденти­фикации некоторых бактерий. Наличие включений в виде зерен волютина позволяет дифференцировать возбуди­телей дифтерии от непатогенных представителей того же семейства, сходных по морфологии с первыми.

Зерна волютина представляют собой комплекс РНК и неорганических фосфатов. Окрашиваются по методу Леффлера и уксуснокислым метиленовым синим.

Для лучшего выявления зерен волютина служит окраска по Нейссеру. При этом методе цитоплазма окра­шивается в желтый цвет, а гранулы волютина — в сине-черный. Краситель Нейссера состоит из двух растворов, состав которых приведен ниже.

Раствор А. Уксуснокислый метиленовый синий по Нейссеру:

метиленовый синий 0,1 г

96° спирт 2 мл

ледяная уксусная кислота 5 мл

дистиллированная вода 100 мл

Раствор Б. Везувин:

Везувин 2 г

96° спирт 60 мл

дистиллированная вода 40 мл

Смесь кипятят и после охлаждения фильтруют.

Окраска по Леффлеру (простой способ)

На фиксированный мазок на 5—10 минут наливают краску, состоящую из 0,25 г метиленового синего и 100 мл 5% раствора СН₃СООН. Мазок промывают и высуши­вают.

Цитоплазма окрашивается в светло-сиреневый цвет, зерна волютина в темно-лиловый.

Окраска по Нейссеру (сложный способ)

На фиксированный мазок наливают раствор А на 1 минуту, затем его сливают, мазок промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 секунд. Не промывая мазок водой, наливают раствор Б на 10-15 минут, после чего мазок промывают и микроскопируют.

Контрольные вопросы

1. Из чего состоит цитоплазма?

2. Чем образованы включения?

3. Какое значение имеет наличие некоторых включений?

4. Перечислите методы окраски включений.

5. Для чего служит окраска по Нейссеру?

6. В какой цвет окрашивается цитоплазма и зерна волютина при использовании метода Нейссера?

Задание. Приготовьте и зафиксируйте мазки из культуры бактерий дифтерии. Окрасьте мазок с помощью простого и сложного методов окраски. Изучите препараты под микроскопом и зарисуйте в тетрадь цветными карандашами.

Опишите методы окраски.

Капсула

Некоторые виды бактерий образуют капсулу, которая защищает их от неблагоприятных воздействий внешней среды. Капсула образуется за счет утолщения оболочки клетки. Она может отделяться от оболочки в виде само­стоятельного секретирующего слоя. Состоит капсула из полисахаридов, иногда протеинов. Выявление капсул воз­можно с помощью окраски по Бурри-Гинсу.

Контрольные вопросы

1. Какой оболочкой обладают бактериальные клетки?

2. Каково строение и химический состав оболочки?

3. При каких условиях образуется капсула?

4. За счет какого структурного элемента клетки образуется кап­сула?

5. Является ли капсула самостоятельным слоем?

6. Химический состав капсулы.

7. Какой метод окраски служит для выявления капсул?

Задание. Окраска капсул по Бурри-Гинсу. На предметное стекло нанести пипеткой каплю исследуемой культуры (антракоида) и черной туши, разведенной водой в 10 раз. Каплю равномерно рас­пределить по поверхности и высушить на воздухе. Затем налить 2-3 капли спирта и сжечь его на стекле. Этим достигают фиксации мазка. На подставку для окраски положить препарат, налить фуксин Пфейффера на 3-5 минут. Промыть водой и высушить. Изучить под микроскопом с помощью иммерсионной системы. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсула не окрашивается, контрастно выделя­ется на темном фоне препарата. Препарат зарисовать цветными карандашами. Запишите в тетрадь способ окраски по Бурри-Гинсу.

Споры

Одним из способов переживания неблагоприятных ус­ловий внешней среды у некоторых бактерий является об­разование спор. Бактерии, образующие споры, называ­ются бациллами. Споры имеют круглую или яйцевидную форму. Они могут располагаться в центре клет­ки - центрально, близко к концу — субтерминально и на конце — терминально. Расположение спор имеет диа­гностическое значение. Споры окрашивают по методу Ожешко и методу Пешкова.

Задание. Ознакомьтесь с рис. 4 - I, зарисуйте в тетрадь возможные варианты расположения спор.

Окраска спор

Окраска спор по методу Ожешко. Мазок высушивают на воздухе, наливают несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты и подогревают до образования паров.

Затем препарат промывают водой, высушивают, фиксируют над пламенем и окрашивают по способу Циля-Нильсена. Споры имеют розово-красный, а бактериальная клетка — голубой цвет.

Окраска спор по методу Пешкова. На мазок, фиксированный в пламени, наносят несколько капель метиленового синего по Леффлеру. Препарат нагревают в средней части пламени, кипятят 15—20 секунд, не допуская высыхания.

Остывший препарат промывают водой, докрашивают 0,5% раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Затем снова промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в голубовато-синий цвет, а бактериальная клетка - в розовый.

Контрольные вопросы.

1. Назовите причину образования спор.

2. Как называются бактерии, образующие споры?

3. Какой формы могут быть споры?

4. Расскажите о расположении спор.

5. Какими методами окрашивают споры?

Жгутики

Некоторые бактерии имеют жгутики - органеллы движения. Жгутики состоят из белка - флагеллина. Дли­на жгутиков может во много раз превышать размер самих бактерий. Жгутики берут начало в цитоплазме и располагаются по поверхности бактериальной клетки. По характеру расположения жгутиков подвижные бактерии делят на четыре группы: 1) монотрихи - бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион); 2) амфотрихи - бактерии с пучком жгутиков на обоих полюсах клетки; 3) лофотрихи - бактерии с пучком жгутиков на одном конце (фекальный щелочеобразователь); 4) - перитрихи — бактерии со жгутиками, расположенными по периферии бактериальной клетки (кишечная палочка и др.).

Контрольные вопросы.

1. Как передвигаются бактерии?

2. Из чего состоят жгутики?

3. На какие группы делят подвижные бактерии и почему?

Задание. Ознакомьтесь с рис. 4 – II. Зарисуйте его в тетрадь.

Изучение подвижности бактерий

Для изучения формы и подвижности бактерий исполь­зуют микроскопию в неокрашенной культуре. С этой целью готовят препараты висячей и раздавленной капли.

Исследование висячей капли. Используют специальное стекло с луночкой, покровное стекло, вазелин. Края луночки покрывают небольшим слоем вазелина. На покровное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю исследуемого материала.

Если исследуемая культура выращена на плотной питательной среде, то на покровное стекло наносят взвесь бактерий в физиологическом растворе. Затем осторожно стеклом с луночкой накрывают покровное стекло с каплей культуры так, чтобы капля оказалась в центре. Получается герметически за­крытая камера. Склеившие­ся стекла быстро переворачивают вверх покровным стеклом (рис. 5).

Если препарат приготов­лен правильно, капля будет висеть в камере и не высохнет в течение длительного времени. Определение подвижности во многих случаях является дифференциальным признаком возбудителя.

Исследование раздавленной капли. На предметное стекло наносят пипеткой каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. Желательно, чтобы при этом не об­разовались пузырьки воздуха, мешающие изучению пре­парата под микроскопом. Чтобы препарат быстро не вы­сыхал, его помещают во влажную камеру. Влажная ка­мера представляет собой чашку Петри, на дно которой положена влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Для исследования препарат извлекают и микроскопируют так же, как и препарат висячей капли.

Подвижность изучают в темном поле, для создания которого слегка опускают конденсор или используют спе­циальный темнопольный конденсор.

Контрольные вопросы

1. Какие Вы знаете методы изучения подвижности микроорганизмов в неокрашенном виде;

2. Расскажите об исследовании висячей капли.

3. Расскажите об исследовании раздавленной капли.

4. С какой целью и как готовят влажную камеру?

Задание. 1. Приготовьте препарат висячей капли из культуры выращенных на жидкой питательной среде.

2. Приготовьте препарат раздавленной капли. Изучите приготовленные препараты под микроскопом.

При малом увеличении найдите край капли, имеющий волнистые блестящие очертания. Затем найдите центр препарата. Манипулируя макровинтом, найдите пол, зрения.

Внимание! Осторожно работайте макровинтом, не раздавите объективом покровное стекло.

Если при работе культура попала на рабочий стол или Вы раздавили препарат, немедленно обработайте загряз­ненную поверхность и руки дезинфицирующим раствором.

После окончания работы положите препараты в специальную посуду с дезинфицирующим раствором. Стекла с луночкой и покровные стекла моют отдельно.

Зарисуйте в тетрадь общий вид приготовленного препарата и отдельное поле зрения.

Самостоятельная работа

Тема работы: «Морфология бактерий и окраска их по Грамму»

Группа __________ Фамилия ________________________ Количество ошибок ______________

Названия бактерий	Форма			Окраска по Граму
	круглая	палочковидная	извитая	Положительная	Отрицательная
Стрептококк
Стафилококк
Пневмококк
Гонококк
Менингококк
Кишечная палочка
Палочка газовой гангрены
Палочка дифтерии
Палочка проказы
Холерный вибрион

Примечание: наличие признака обозначается знаком +.

Тема работы: «Капсула и споры бактерий»

Группа __________ Фамилия ________________________ Количество ошибок ______________

Названия бактерий	Капсульные	Образующие только в организме		Названия бактерий	Образующие споры	Необразующие споры
Пневмококк				Палочка брюшного тифа
Менингококк				Палочка столбняка
Палочка сибирской язвы				Палочка ботулизма
Палочка чумы				Палочка чумы
Палочка туляремии				Палочка дифтерии

Примечание: В соответствующей графе поставить знак +