10,Бөгде генді айқындау әдістері. Днқ тізбегінің нуклеотидтік ретін анықтау әдістері. Пцр.

Қажет генді барлық бактериялар массасынан алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда бактерияның әрбір жеке клеткасы жеке ұрпақ береді яғни бактериялық шоғыр түзіледі.Енді гендер жинағын яғни әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы әдістер қолданылады. Кең тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін Петри шынысындағы негативтік шоғырларға (рДНҚ-сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.

Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комалементарлық ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) — сүңгімен тексереді.Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана гибридизацияланады (байланысады). Бұның негізінде ДНҚ-РНҚ-сүңгі гибридтерінің құрылуы жатады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін бұзады.Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі радио-аутография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.

Сонымен біз қажет гені бар ДНҚ фрагментін бөліп алдық, алайда, ол әлі де болса геннің өзінен ұзындығы бойынша бірнеше нсе үлкен. Фагтық вектордың ішіне орта есеппен 15—20 мың н.ж. сиятындай етіп құрастырылатыны естеріңізде болар, ал геннің орташа ұзындығы — 1-2 мың н. ж. Міне сондықтан да жеке генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды. Гендер жинағынан бөлінген ДНҚ сегментін қайтадан әр түрлі рестриктазалармен үзеді, осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге ауыстыру басталады. Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнешн құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді. Сонымен электрофорездегі рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 10⁹ н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды.

Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады.

11. Бөгде генді айқындау әдістері. Иммуноблоттинг және нуклеин қышқылдарын гибридизациялау әдістері.

Иммуноблоттинг (вестернблоттинг) – иммуноферментативті анализге негізделген (ИФА) белоктарды анықтаудың сезімталдылығы жоғары әдісі. Бұл әдіс белоктық антигендерді зерттеу әдісі. Белоктарды электрофорез көмегімен бөледі де мембранаға тасымалдайды. Одан кейін мембрананы антидене ерітіндісінде инкубациялайды, байланысқан антиденелерді радиоизотопты және иммуноферментативті анализ арқылы анықтайды.

Саузерн және Нозерн блот анализдері.

Нозерн блоттинг. Гендердің экспрессиясын РНК-молекулаларын (мРНК) және оның фрагменттерін тестілеу арқылы зерттеу әдісі. Әдісті 1977ж. Джеймс Олвайн, Дэвид Кемп және Джордж Старк ұсынды.

Әдіс

• Жоғарғы мол-лы РНК-ны ұсақ фраг-ге бөлу үшін рестрик-қ эндонук-мен кеседі.

• РНК мол-н агарозды гельде электрофорез жүргізеді

• Егер кейбір фрагменттер 15кб-ден ұзын болса, гельді тұз қыш-мен өңдейді, ол РНК-ның депуринизациясын шақырып, фильтрге тасымалдануын жеңілдетеді.

• Ауыстырудың сілтілі әдісін таңдаған кезде агарозды гелді сілтілі ерітіндіге салады, сол кезде РНК денатурацияланады және теріс зарядталған РНК-ның оң зарядталған мембранамен байланысуын жеңілдетеді.

1. Диазобензилоксиметил-целлюлозды фильтрді агарозды гельдің үстінен немесе астынан жабады. Қысымды гельге немесе бірнеше қабат қағаздан жібереді. Ауысу сәтті жүру үшін гель мен мембрананың тығыз байланысуы қажет. Буфер капиллярлы күшпен су аз жақтан су көп жаққа тасымалданады. Сол уақытта, РНК-ның гельден мембранаға тасымалдануы жүзеге асады. Полианионды РНК оң зарядталған мембранамен ионалмасу әсерлерінң күші арқ байланысады.

2. РНК-ның мембранада нақты орнығуы үшін мембрананы ваккумда 80гр С темп-да 2сағат бойы қыздырады, немесе ультракулгін сәулемен жарық-жы(нейлонды мембрана).

3. Радиоактивті белгімен таңбаланған (флюоресцентті) нуклеотид тізбегі белгілі ДНК-ның біртізбекті комплементарлы олигонуклеотидтерімен гибритизациясын жүзеге асырады.

4. Гибритизациядан соң артық қалған зондтарды мембранадан жуып тастайды, және радиоавтография арқ өнімдерді визуализациялайды.

Саузерн блоттинг. Үлгідегі арнайы ДНК-ны кезектесу тәртібін анықтайтын молекулалық биологияда қолд-тын әдіс. Әдіс бойынша ДНК-ны фракциялау үшін агарозды гельде электрофорез жүргізеді, кейін оны мемранды фильтрге гибритизациялау үшін ауыстырады. Әдістың аталуы оны ұсынған адамның есімімен байланысты, Эдвин Саузерн.

Әдіс

1. Жоғарғы мол-лы ДНК-ны ұсақ фраг-ге бөлу үшін рестрик-қ эндонук-мен кеседі.

2. ДНК мол-н агарозды гельде электрофорез жүргізеді

3. Егер кейбір фрагменттер 15кб-ден ұзын болса, гельді тұз қыш-мен өңдейді, ол ДНК-ның депуринизациясын шақырып, мемб-ға тасымалдануын жеңілдетеді.

4. Ауыстырудың сілтілі әдісін таңдаған кезде агарозды гелді сілтілі ерітіндіге салады, сол кезде ДНК-ның кос тізбегі денатурацияланады және теріс зарядталған ДНК-ның оң зарядталған мембранамен байланысуын жеңілдетеді, сондай-ақ РНК өалдықтары да ыдырайды.

5. Нитроцел-ды немесе нейлонды қағазды агарозды гельдің үстінен немесе астынан жабады.Қысымды гельге немесе бірнеше қабат қағаздан жібереді. Ауысу сәтті жүру үшін гель мен мембрананың тығыз байланысуы қажет. Буфер капиллярлы күшпен су аз жақтан су көп жаққа тасымалданады. Сол уақытта, ДНК-ның гельден мембранаға тасыымалдануы жүзеге асады. Полианионды ДНК оң зарядталған мембранамен ионалмасу әсерлерінң күші арқ байланысады.

6. ДНК-ның мембранада нақты орнығуы үшін мембрананы ваккумда 80гр С темп-да 2сағат бойы қыздырады, немесе ультракулгін сәулемен жарық-жы(нейлонды мембрана).

7. Радиоактивті белгімен таңбаланған (флюоресцентті) нуклеотид тізбегі белгілі ДНК-ның біртізбекті олигонуклеотидтерімен гибритизациясын жүзеге асырады.

Гибритизациядан соң артық қалған зондтарды мембранадан жуып тастайды, және радиоавтография арқ өнімдерді визуализациялайды.

11. Генетикалық ақпараттың жүзеге асуы. Прокариот гендерінің экспрессиясын реттеуші элементтер.

Прокариотты гендер экспрессиясының реттелуі. Оперон үлгісі

Прокариоттардағы генетикалық активтіліктің транскрипциялық бақылану құбылысын көрсетудің классикалық мысалына -галактозидаза ферменті синтезінің реттелу жүйесін жатқызуға болады. E.сoli бактериялары көміртегі мен энергияның бірден-бір көзі ретінде лактозаны пайдалануы мүмкін, себебі олар лактоза дисахаридін галактоза мен глюкозаға дейін ыдырататын фермент -галактозидазаны көп мөлшерде түзе алуға қабілетті. E.сoli-дегі лактозаны ыдырататын ферментті кодтайтын гендер қызметінің реттелу механизмдерін зерттеу 1961 жылы Франция ғалымдары Ф.Жакоб, Ж.Моно, және А.Львовқа құрылымдық гендер жұмысының үйлесімді түрде бақылануының моделін ұсынуға мүмкіндік берді, ол оперон моделі деп аталады. Бактериялардағы гендер активтілігінің реттелуі механизмдерін ашқандары үшін Ф.Жакоб, Ж.Моно және А.Львовқа 1965ж. Нобель сыйлығы берілді.

Оперон моделі бойынша қызметі жағынан бір-бірімен тығыз байланысты, полипептидтерді кодтаушы құрылымдық гендер тобының транскрипциясы екі бақылаушы элементтер – реттеуші-ген және оператор арқылы реттеледі. Құрылымдық немесе ферментативтік қызмет атқаратын клетка үшін қажетті белоктарды кодтайтын гендерді құрылымдық гендер деп атайды. Басқа гендердің экспрессиясын реттейтін белоктарды кодтайтын гендерді реттеушілер дейді. Оператор көбінесе транскрипцияның инициациясы үшін қажетті промотор мен құрылымдық гендердің аралығында шоғырланған құрылымдық гендерге келіп қосылатын нуклеотидтердің тізбегі болып табылады. Бір-бірімен тығыз байланысқан құрылымдық гендер, оператор және промотордан тұратын, үйлесімді түрде экспрессияланатын гендердің тобын оперон деп атайды. 13.2-суретте E.сoliдің lac – оперон гендерінің құрылысы берілген, ол осы уақытқа дейінгі ең бір жақсы сипатталған оперон болып табылады. Осы lac–оперонға 6000 жұпқа шамалас ДНҚ нуклеотидтері сәйкес келеді.

Реттеуші белоктар бұл қызметі ДНҚ-ғы белгілі бір сайттармен біріге отырып атқарады. Мұндай әсерлердің өзі негізінде реттелудің түріне байланысты болады. Егер реттеуші геннің өнімі белок – репрессор болып келсе, оның операторға келіп қосылуы құрылымдық гендердің транскрипциясына жол бермейді, сөйтіп РНҚ-полимеразаның промоторға қосылуына кедергі келтіреді. Керісінше, егер реттеуші белок қызметін активті апоиндуктор атқарса, оның операторға келіп қосылуы транскрипцияның инициациясына жағдай туғызады.

13.2-сурет. E.сoli-дің lac – опероны (11).

Реттеуші ген оперонның маңында немесе одан алысырақ орналасуы мүмкін. Мысалы, E.сoli-де галактозаның метаболизміне (алмасуына) жауапты ферменттерді кодтайтын үш ген – galE, galT және galK өзіне реттеуші сегмент-оператор арқылы келіп қосылатын промоторы бар оперонда орналасады. Арабинозаны пайдалану үшін қажетті ферменттердің синтезі екі жеке транскрипциялық бірліктермен реттеледі.

Оперонның жұмысын реттеуге сол сияқты төменгі-молекулалы заттар- эффекторлар да қатысады, олар оперонның құрылымына енетін құрылымдық гендердің индукторы не корепрессоры есебінде болады.

Эффектор–молекулалардың өз жұмысына әсер ету жолына қарай оперондарды индукциялаушы және репрессиялаушы деп ажыратады. Индукциялаушы оперондарда эффектор белок репрессорға келіп қосылады да оның оператормен бірігуіне жол бермейді. Сөйтіп құрылымдық гендердің транскрипциясына кедергі келтіреді. Оперон жұмысы реттелуінің мұндай түрін негатитвті деп атайды. Сонымен қатар индукцияланатын оперондар реттелудің позитивті бақылауында да бола алады, ол кезде эффектор реттеуші белокпен байланысып, оны активтендіреді. Позитивті реттелу арнайы белоктарды промотор аумағында орналасқан нуклеотидтік тізбектермен байланыстыру арқылы жүзеге асады. Активті апоиндуктор операторға келіп қосылып оперонның транскрипциялану мүмкіндігін тудырады. Реттелуді бақылаудың екі түрі репрессияланатын оперондар тұрғысынан да әсер етеді.

11. Транскрипция және трансляция деңгейлеріндегі гендер экспресиясының реттелу механизмдері туралы түсінік.

Гендер экспрессиясының реттелуі

Гендер экспрессиясының дифференциалды реттелуін жүзеге асыру қабілеті прокариоттар мен эукариоттардың негізгі қасиеті болып есептеледі. Қандай гендердің экспрессиялануы керек, қайсыларына керегі жоқ екендігіне бақылау жасай отырып, сол сияқты түрлі гендер экспрессиясының деңгейін реттей келе клеткалар өз фенотипін белгілі бір сыртқы және ішкі орта жағдайларына бейімдей алады. Гендер көбінесе біртіндеп экспрессияланады: бір геннің активациясы басқа бірнеше гендердің экспрессиясын тудыра алады. Қайсыбір гендер немесе туыстас гендердің тобы үйлесімді түрде экспрессияланады, яғни реттеуші сигналға бір мезгілде және бірдей деңгейде жауап береді. Синтездің бір белоктан басқаларына ауысуы кез-келген дамудың, мейлі ол залалданған клеткадағы вирустардың репродукциясы, бактериялардағы спора түзілу, эмбриондардың дамуы немесе ұлпалардың жіктелуінің болсын негізін құрайды. Әртүрлі клеткаларда гендердің түрлі жиынтықтары транскрипцияланады. Бұл процестердің әр кезеңінде өзіндік ерекшелігі бар белоктар синтезделеді.

ДНҚ-дан белокқа алып баратын жолда мұндай бақылау кез-келген кезеңде жүзеге аса алады (13.1-сурет).

13.1-сурет. Эукариоттарда гендер экспрессиясы бақылануының болуға тиісті деп ұйғарылған кезеңдерін көрсететін сызбанұсқа (11).

Гендер экспрессиясының реттелуі мынандай деңгейлерде жүруі мүмкін:

• Транскрипция деңгейіндегі бақылау (геннің транскипциялану уақыты мен сипаты)

• Процессинг деңгейіндегі бақылау (алғашқы транскрипт процессингінің сипаты)

• Транспорт деңгейіндегі бақылау (цитоплазмаға тасымалдауға арналған ядродағы жетілген мРНҚ-ны сұрыптау)

• Трансляция деңгейіндегі бақылау (рибосомалардағы трансляция үшін қажетті цитоплазмадағы мРНҚ-ны сұрыптау)

• мРНҚ деградациясы деңгейіндегі сұрыптау (цитоплазмадағы мРНҚ-ның белгілі бір түрлерін таңдап тұрақтандыру)

Транскрипция процесінде РНҚ құрамын реттеу генетикалық экспрессияны реттеудің аса маңызды және тиімді жолы болып табылады. Транскрипция деңгейіндегі бақылау әсіресе біршама тұрақсыз мРНҚ жағдайында аса қажет. Өз кезегінде посттранскипциялық құбылыстар да реттеліп отырады және клеткада РНҚ-ның функционалдық молекулаларының болуы да соған байланысты. Ген өнімдері экспрессиясының трансляциялық реттелуі рибосомаларда трансляцияланатын мРНҚ-ның сұрыпталуын қамтамасыз етеді. Ген әрекеттерін бақылау функционалдық деңгейде полипептидтердің посттрансляциялық модификациясы және ферменттер активтілігін аллостерикалық реттеу жолдарымен жүзеге асады. Эукариоттарда транскипция трансляциямен тікелей қатынаста болмайтындықтан цитоплазмадағы мРНҚ-ның белгілі бір түрлерінің деградациясы мен таңдамалы тұрақтануы деңгейіндегі гендер экспрессиясының цитоплазмалық бақылануы жүзеге асады.

Сонымен қатар гендер экспрессиясының реттелуі хроматин жағдайының, соның ішінде нуклеосомалар қатталуының өзгерісі жолымен жүруі мүмкін. Бұл экспрессия реттелуінің тағыда бір деңгейін туғызады. Нуклеосомалық реттеуші механизмдер бір ғана генге тән болмайды, көптеген гендердің экспрессиясына әсер етеді.

Бактерияларда көбірек зерттелген реттелудің транскрипциялық деңгейін біршама кеңірек қарастырайық.

Бактериялар қоршаған ортадағы өзгерістерге тез жауап беруге тиісті. Олардың өз тіршілігін сақтауы метаболизмді бір субстраттан екіншісіне ауыстыру қабілетіне байланысты, себебі, олардың тіршілік ортасына қоректік заттардың келіп түсуі тұрақты түрде өзгеріп отыруы мүмкін. Бактерия қандай да болмасын метаболиттік бағыттағы ферментті оған тиісті субстраты жоқ жағдайда синтездей алмайды, бірақ ондай жағдай бола қалса ферментті синтездеуін кез-келген уақытта бастап жіберуге қабілетті. Бактерия гендері қызметінің басты ерекшеліктері осы мен түсіндіріледі бұл олардың кластарға бірігуіне және экспрессия реттілігіне байланысты. Гендердің кластерлерге бірігетіндігі соншалықты, биосинтездің белгілі бір бағыты үшін қажетті ферменттердің барлығы бір-бірімен тіркескен гендер арқылы анықталады. Гендердің бүкіл тобы бір полицистронды (полигенді) мРНҚ-ға транскрипцияланады, ал одан әрі қарай біртіндеп рибосомаларда трансляцияланып түрлі белоктарды түзеді.

11. Бактериялық гендердің оперондық құрлымы. Лактозалық опероны негізіндегі Ж. Моно және Ф. Жакоб теориясы. Триптофан опероны.

E.сoli lac – оперонының экспрессиясының реттелуі

-галактозидазаның (lacZ) синтезіне жауапты ген индуцибельді деп аталады, себебі ол кодтайтын фермент тек клеткада лактоза болғанда ғана синтезделеді. Екінші ген lacY – клеткаға лактозамен қоса қанттарды тасымалдауды қамтамасыз ететін галактозидпермеазаны кодтайды. Үшінші ген lacA - -галактозид - трансацетилазаны кодтайды, ол фермент ацетильді топты ацетил коэнзимА-дан В-галактизидке алып барады, сөйтіп бактерияның өсуіне қолайлы жағдай туғызады. Осы үш генде – lacZ, lacY және lacA-да lac-оперонмен кодталынатын белоктар жайлы барлық ақпарат болады. Бұл үш lacZ, -Y, -A гендерінің кластері lacZ геніне жақын тұрған промотордан бір мРНҚ түрінде транскрипцияланады. Барлық үш ферментте әдетте бактерия клеткаларында шамалы мөлшерде болады. Алайда, бактерияларды энергияның бірден-бір көзі лактоза болатын ортада өсірген кезде аталған ферменттердің мөлшері 1000 есеге дейін артады.

Сол жақ бөлігінде өзінің жеке промоторы бар lacI гені орналасады және оның терминатор да болуы мүмкін. LacI генінің кодтаушы бөлігінің ұшы тікелей lacP - промоторымен түйіседі. Операторға lacZ генінің алғашқы 26 жұп негіздері сәйкес келеді. LacZ генінен соң lacY, lacA гендері мен терминатор орналасады.

келіп қосылады.

LacZ және lacY гендерінің мутациясы клетка лактозаны пайдалана алмаған кезде Lac фенотипін береді. LacZ мутанттарында -галактозидазаның ферменттік активтілігі болмайды. LacY гені бойынша мутанттар сыртқы ортадан лактозаны өзіне сіңіре алмайды.

Лактозалық оперонның қызметі мынандай жолмен жүреді: lacZ, lacY және lacA гендерінің транскрипциясы lacI генімен кодталатын белок репрессормен бақыланады. LacZ, lacY және lacA гендері негатативті түрде бақыланады, яғни транскрипция белок-репрессордың көмегімен тоқтап қалғанша жүре береді. Репрессор геннің мутациясы lacZ, lacY және lacA гендерінің тұрақты транскрипциялық активтілігін тудырады. Lac- репрессор белогы оператормен lacZ, -Y, -A кластерінің транскрипциясы басталар кезде байланысып РНҚ-полимеразаның қозғалысы мен транскрипциясының инициациясын жояды (13.3-сурет).

Белок репрессорда біреуі индуктормен, ал екіншісі оператормен байланысатын екі сайты болады. Индуктор (лактоза) клеткаға барып өз сайтымен байланысқан кезде, белоктың конформациясы өзгереді де басқа сайттың байланыстырғыш қабілеті бұзылады. Нәтижесінде репрессор транскрипцияны ұстап тұра алмайтындықтан ол басталып кетеді (13.4-сурет, А). Индуктор істен шыққан кезде репрессор оператордағы өз орнына қайтадан ие болып, транскрипцияны тоқтатады.

Қанттардың метаболизміне қатысатын ферменттердің синтезіне бақылау жасайтын lac-оперонының және тағы да басқа индуцибелді оперондардың экспрессиясы үшін тек оперонның репрессиясын алып тастау ғана емес, қайсы бір сигналды алу да қажет. Ондай сигнал үшін циклді АМФ-ты (цАМФ) катаболизмнің активаторы белогымен (САР, ағылшынша catаbolite activator protein) түзетін комплексі қызмет атқарады. Ол lac-промотордың ең басынан басталатын ерекше тізбектермен байланысады. САР-тың өзі молекулалық массасы 22 кДа болатын біртекті полипептидті тізбектердің димері болып табылады. Промотордың бас жағында САР-цАМФ комплексін ерекше жүйемен байланыстыру lac-оперон транскрипциясын 50 есеге жуық арттырады. САР өздігінен мұндай байланыстыруға және транскрипцияны жеделдетуге қабілетсіз. САР және цАМФ-ті реттейтін барлық гендердегідей, промотордың екі аумағы болады: РНҚ-полимеразамен байланыстыратын бөлімшесі және САР-цАМФ комплексімен байланыстыратын бөлімшесі (13.5-сурет).

Микроорганизмдердегі гендердің оперондық құрылымының негізгі ерекшелігі активтіліктің реттелуінің үйлесімділігі болып табылады, яғни бүкіл гендер экспрессияланса да немесе экспрессияланбаса да бірге қосылып қызмет атқарады. Матрицалық РНҚ-ның трансляциясы 5- ұшынан біртіндеп жүзеге асырылады. Бұл неге индукция кезінде алдымен -галактозидаза, содан соң -галактозидпермеаза және ең соңында, -галактозид-трансацетилаза пайда болатындығын түсіндіреді. Сол сияқты біртұтас мРНҚ- ның көмегімен үш геннің көрініс беруінің өзі барлық үш ферменттің салыстырмалы шамасы индукцияға қарамастан неге бірдей болып қалатындығын түсіндіреді.

Бір-біріне жақын бірнеше функцияларды кодтайтын гендер барлық жағдайда біртұтас оперон түзе бермейді. Мысалы, 30S және 50S-рибосомалық белоктарды кодтайтын гендер көптеген оперондарды құрайды.

Эукариоттардан оперондар табылмаған.

Триптофан оперонының экспрессиясының реттелуі

Оперон гендер тобын үйлестіре реттеуге мүмкіндік беретін құрылым болып есептеледі. Сонымен қатар жекелеген гендердің әртүрлі дәрежедегі экспрессиясын қамтамасыз ететін бақылаудың басқа да тәсілдері болуы мүмкін. Мысал ретінде триптофан оперонының реттелуін қарастыруға болады.

Триптофан E.сoli–де бес түрлі белоктан тұратын ферменттік комплекспен катализденетін бірінен соң бірі қатар келетін бес түрлі реакцияның нәтижесінде хоризм қышқылынан синтезделеді. Ферментативтік реакциялардың бұл тізбегі trp-оперонды құрайтын бес құрылымдық гендермен кодталады (13.6-сурет). TrpA және trpВ гендері өз кезегінде - және - триптофансинтетаза суббірліктерін анықтайды, trpЕ және trpD гендерінің өнімдері бірігіп антрацилсинтетаза ферментін түзеді, ал trpС гені индолглицерофосфатсинтетазаны кодтайды.

Trp-оперонымен кодталатын белоктар бірлескен түрде, шамамен бірдей мөлшерде промотормен транскрипцияланатын ұзындығы 7000 нуклеотидтерден тұратын полицистронды мРНҚ трансляциясы кезінде пайда болады. Ортада бактерияның өсуіне жеткілікті мөлшерде триптофан болған жағдайда E.coli клеткасы өте аз мөлшерде триптофан биосинтезіне қажетті ферменттерді түзе алады. Алайда егер клеткада экзогенді триптофан жоқ болса, онда барлық бес ферменттің де біршама қарқынды синтезі басталады. Клетка ішіндегі триптофанның мөлшеріне қарай бактерия клеткаларындағы фермент мөлшері 700 есеге дейін көбейе алады. Триптофандық оперонға талдау жасалғанда реттеуге промотор-оператор комплексінен бөлек тағы да басқа сайттың қатысатындығын көрсетті. Мұндай реттеуші сайт аттенуатор деп аталады. Ол 162 нуклеотидтен тұратын транскрипцияланатын басты тізбектің аумағында шоғырланған, ал бұл trpЕ генінің инициациялаушы кодонның алдында болады. Аттенуатор РНҚ-полимеразаның trp гендері аймағына қарай жылжуын қадағалайды және транскрипция үшін кедергі қызметін атқарады. Ол терминацияның Р-тәуелсіз сайты түрінде болады және терминациялық тізбектің құрамына ГЦ-ға бай аймақ енеді, ал олар терминаторлық полиндромды бізшелер (шпильки) түзеді. РНҚ-полимераза транскрипцияны осы бөлімшеде тоқтатады; нәтижесінде ұзындығы 140 негізден тұратын транскрипт пайда болады.

Бұл сайттағы терминация триптофанның болуына байланысты. Триптофанның деңгейі төмен болған жағдайда атенуаторлы тізбектің маңайындағы транскрипция терминациясы шектеледі де, РНҚ-полимераза құрылымдық гендерді транскрипциялауы әрі қарай жалғастыруға мүмкіндік алады. Триптофанның мөлшері жеткілікті болса терминация жақсы жүреді. Транскрипция терминациясының осылайша реттелуі аттенуация деп аталады.

Аттенуация E.сoli–дің және тағы да басқа бактериялардың көптеген гендері мен оперондарының экспрессиясының реттелуі кезінде қолданылады. Гистидиннің биосинтезіне қатысатын тоғыз ферментті кодтайтын оперон тек қана аттенуацияның көмегімен реттеледі. Олардың құрылымындағы ерекшелік мРНҚ-да терминациялаушы бізшелердің пайда болуына алып келетін полиндромның болуына байланысты. Промотордағы транскрипция инициациясы мен аттенуациясы нәтижесін өзгертетін репрессия механизмдерінің үйлесімі транскрипциялық деңгейдегі, сыртқы орта жағдайларына икемді ген экспрессиясы реттелуінің біршама тиімді болуын қамтамасыз етеді.

11. Индуцебельді ферменттердің синтезін реттеуші репрессорлар.