3.1 Материалы и методы

Всего в исследование включен 81 мужчина и 59 женщин (140 пациентов), поступавших в отделения острых респираторных вирусных инфекций ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы в состоянии средней тяжести с направительным диагнозом: «ОРВИ» либо «Грипп». Средний возраст больных — 35,5 ± 1,6 года (от 15 до 87 лет). Критериями включения пациентов в исследование были: наличие симптомов гриппа и ОРВИ (повышение температуры тела, симптомы интоксикации и катарального воспаления дыхательных путей); обследование двумя методами для подтверждения гриппа (прямая ИФ и ПЦР) в первые двое суток от момента поступления больного в стационар. При этом материал, взятый от больного для проведения этих исследований, должен был содержать достаточное количество клеток эпителия носоглотки для анализа. Критериями исключения из исследования были: наличие хронической обструктивной болезни легких, беременность.

Всем пациентам, включенным в исследование, проводилось стандартное общеклиническое обследование: сбор анамнеза заболевания, объективный осмотр, анализ клинической картины в сопоставлении с данными лабораторно-инструментальных методов исследования (общие анализы крови и мочи, рентгенологическое исследование органов грудной клетки). Для оценки степени дыхательной недостаточности больным проводилась пульсоксиметрия. При наличии у пациента пневмонии по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки дополнительно назначался биохимический анализ крови (определение уровней аланин­аминотрансферазы (АлАТ), аспартат­аминотрансферазы (АсАТ), мочевины, креатинина, креатининфосфокиназы), а также анализ крови для оценки кислотно-основного состояния и электролитов.

Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось при помощи ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для выявления генетического материала вирусов гриппа А (сезонного), гриппа А (H1N1) pdm09, гриппа В в эпителии носоглотки/ротоглотки при помощи тест-систем «АмплиСенс®» с аналитической чувствительностью — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.

Иммунологическое исследование выполнялось при помощи метода прямой ИФ. Диагностикум представляет собой специфические моноклональные антитела (иммуноглобулины), меченые флуоресцеинизотиоцианатом. В работе использовались серии диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г. Санкт-Петербург), рабочее разведение диагностикумов было не ниже 1:16. Анализ мазков-отпечатков из носоглотки проводился с помощью люминесцентного микроскопа «Биомед-6» (Россия).

3.2 Результаты

Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа больных (n = 140), в которой были применены одновременно эти две методики с целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на три подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты, у которых диагностика гриппа двумя методиками проводились в один день; 2-я подгруппа — пациенты, которым ПЦР было выполнено раньше метода ИФ на 1–2 суток; 3-я подгруппа — пациенты, которым метод прямой ИФ был проведен раньше ПЦР на 1–2 суток. Результаты исследования эпителия носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование, представлены в табл. 1–3.

Выполнено сравнение частоты регистрации четырех комбинаций (профилей) результатов тестов прямой ИФ и ОТ-ПЦР: ИФ«+»/ПЦР«+», ИФ«-»/ПЦР«+», ИФ«+»/ПЦР«-», ИФ«-»/ПЦР«-».

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0005 и p = 0,0019 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 37), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой, но достоверно отличалась только от частоты выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0078), в то время как достоверной разницы с частотой выявления профиля ИФ«+»/ПЦР«+» не выявлено (p = 0,0868).

Как видно из табл. 1, в группе больных (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%) пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то время как в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа выявить не удалось.

В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.

В группе больных (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым исследование ОТ-ПЦР было выполнено на 1–2 дня раньше прямой ИФ и в 1–3 дня от начала болезни, грипп был подтвержден у 9 пациентов, и только методом ОТ-ПЦР в 100% случаев (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 40), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ«-»/ПЦР«+» была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ«+»/ПЦР«+» и ИФ«+»/ПЦР«-» (p = 0,0006 и p = 0,0002 соответственно).

Как видно из табл. 2, в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 1–3 сутки от начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не удалось ни у одного пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.

В группе больных (n = 39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от момента заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом большинство положительных результатов (90%, 27/30) получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.

В группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, грипп лабораторно подтвержден тем или иным методом у 77,8% (14/17) больных, при этом большинство положительных результатов также было получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 14,3% (2/14) случаев.

В табл. 3 представлены результаты пациентов, у которых исследование методом прямой ИФ было сделано раньше ОТ-ПЦР и обследованных позже 3-го дня болезни. Из трех пациентов, обследованных на 4-й день и позже, грипп был подтвержден в 100% случаев только методом ОТ-ПЦР (профиль ИФ«-»/ПЦР«+»).

В целом, среди всех обследованных, независимо от дня болезни, на который выполнялось исследование, были пациенты (n = 10), у которых при помощи метода прямой ИФ выявлялись антигены вируса гриппа, в то время как методом ОТ-ПЦР выделить генетический материал вируса не удавалось (профиль ИФ«+»/ПЦР«-»). Такое расхождение результатов обследования наблюдалось в 7,1–17,6% случаев, не прослеживалось связи указанного профиля с днем болезни, на который проводилось обследование, однако в группе больных, у которых обследование методом прямой ИФ применялось раньше ОТ-ПЦР, таких пациентов не было.