5. Основные понятия и положения темы (наглядные формы –таблицы и т.Д.)

5.1. Методы определения активности аминотрансфераз

Методы с фиксированным временем инкубации

Основаны на способности кетокислот вступать в реакцию с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) и образовывать гидразоны кето­кислот

Ограничения фотометрического метода определения АсАТ и АлАТ связаны с несколькими факторами.

1. При определении активности аминотрансфераз в среде инкубации могут находиться одновременно по две кетокислоты (при опреде­лении АсАТ — а-кетоглютаровая и ЩУК, АлАТ — а-кетоглютаро­вая и ПВК. Обе кетокислоты легко вступают в реакцию с 2,4-ДНФГ и образуют динитрофенилгидразоны. В начале реакции, катализируемой АсАТ, в инкубационной среде содержится только а-кетоглютаровая кислота, определяющая величину поглощения в контрольной пробе. В ходе реакции ее концентрация снижается, а содержание ЩУК возрастает. В ходе реакции, катализируемой АлАТ, в среде инкубации происходит накопление ПВК и умень­шение содержания а-кетоглютаровой кислоты.

СООН

С ООН

СН₂

СООН ЩУК

+ н„о

СН₃

С = О СООН ПВК

Образование 2,4-динирофенилгидразонов щавелевоуксусной и пировиноградной кислоты

2. Некоторые кетокислоты сыворотки, в частности, ПВК, ацетоуксусная кислоты, ацетон способны к образованию фенилгидразонов. При увеличении их содержания в крови они вызывают уве­личение поглощения инкубационной среды.

3. Максимумы поглощения фенилгидразонов щавелевоуксусной, пировиноградной и а-кетоглютаровой кислоты достаточно близ­ки, но отличаются.

4. Основным недостатком метода является невозможность определе­ния активности фермента в широком диапазоне активности из-за ингибирования фермента АсАТ продуктом реакции — ЩУК, на­капливающейся в среде инкубации при исследовании образцов с высокой активностью. Показано, что ЩУК способна ингибировать оба изофермента АсАТ, митохондриальный изофермент ингибируется в большей степени. При высокой активности АлАТ концентрация субстрата может быстро снижаться, что приводит к отклонению от кинетики нулевого порядка.

Точностные характеристики метода не удовлетворяют требовани­ям, изложенным в приказе МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 г., в связи с чем необходимо переходить к методам, основанным на непрерывной ре­гистрации (кинетическим).

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови с использованием 2,4-динитрофенилгидразина

Об активности ферментов судят по приросту ЩУК и ПВК, обра­зующих с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) гидразоны соответствующих кетокислот при рН 7,1-7,3 , которые приобретают ок­раску в щелочной среде.

Комментарии:

1. Образование гидразонов кетокислот проходит в слабоосновной среде, а максимумом поглощения гидразоны обладают в щелоч­ной среде, в связи с чем концентрацию соляной кислоты и гидроксида натрия следует четко контролировать. Время образования гидразонов кетокислот не должно быть менее 20 мин.

2. Присутствие больших количеств карбоната натрия в растворе может искажать результаты, поэтому рабочий раствор гидроксида натрия (0.4 моль/л) следует готовить из концентрированных растворов гидроксида натрия с концентрацией 400—500 г/л, «вы­ стоявшихся» в течение 1—2 недель. Концентрацию рабочего ра­створа следует проверять с помощью приемов объемного анализа. Приготовленный раствор следует хранить в плотно закупоренной посуде.

3. Калибровочный график для определения активности аминотрансфераз строят с использованием дистиллированной воды вместо раствора субстрата. При корректном построении графика и использовании фотометров типа ФЭК-56, КФК-2, КФК-2МП прямая зависимость между концентрацией ПВК в пробе и поглощением сохраняется до 0.25 мкмоль. При концентрации ПВК в пробе выше 0.25 мкмоль наблюдается отклонение от прямой пропорциональной зависимости. При использовании приборов с узкополосными светофильтрами (КФК-3) или спектрофотометров (СФ-46) прямая пропорциональная зависимость соблюдается до концентрации ПВК в пробе 0.3 мкмоль.

4. В крови больных сахарным диабетом могут в избыточном количе­стве накапливаться кетокислоты и ацетон, способные образовывать соответствующие гидразоны в реакции с 2,4-ДНФГ и ложно завышать результаты определения, если фотометрия будет проводиться не против собственного контроля на реактивы, включаю­щего исследуемый материал.

5. Время реакции при определении АлАТ должно составлять 30 минут, при определении АсАТ — 1 час. Удлинение времени инкубации АлАТ до 1 часа способно привести к завышению результатовпри сравнении с результатами, полученными при 30 минутной инкубации.

6. В основе феномена «эффекта разведения» лежат особенности самого метода, где концентрация кетокислоты является недостаточной для определения высокой активности фермента, однако ее концентрация в среде инкубации не может быть повышена, так как это приведет к увеличению значений контрольной пробы, на фоне которой трудно зафиксировать образование гидразонов ПВК и ЩУК.

Методы непрерывной регистрации (kinetic)

Контроль за скоростью реакции переаминирования осуществляют сочетанием аминотрансферазной реакции с реакцией, катализируемой соответствующей субстрату дегидрогеназой. Кетокислоты, образующие­ся в аминотрансферазной реакции, определяют путем ферментативного превращения в соответствующие гидроксикислоты по изменению кон­центрации НАДН₂ в среде инкубации. Например, ЩУК превращается в яблочную кислоту в присутствии малатдегидрогеназы (МДГ) (рис.), а ПВК превращается в молочную кислоту при участии ЛДГ — непрямой оптический тест Варбурга.

Субстраты, кофермент НАДН₂ и вспомогательные ферменты МДГ и ЛДГ добавляют в среду инкубации в избытке, чтобы скорость реак­ции зависела только от активности АсАТ или АлАТ.

Аспарагиновая

кислота

Яблочная кислота

НАД

а-кетоглютаровая кислота

НАД Н₂

Глютаминовая кислота

Дегидрогеназная реакция

Определение кетокислоты