23. Иммуноферментный метод исследования.

Точность и чувствительность иммуноферментного метода основана на сочетании специфичности и чувствительности антител к свободным антигенам, на изменении удельной активности фермента при связывании антител с антигенами, содержащими ферментную метку. Разработанный в 1972 г. А. И. Рубинштейном иммуноферментный анализ (ИФА) получил всеобщее признание. По мере развития ИФА выделились основные направления его применения: определение антигенов и антител в месте их локализации в клетках и срезах ткани и количественное определение антигенов и антител в биологических жидкостях. Разработано большое количество разновидностей иммуноферментного анализа: прямая и непрямая конкурентные пробы, сэндвич-метод, иммуноферментные электроды и др. Иммуноферментный анализ дает возможность проводить массовые исследования с целью ранней диагностики заболевания и хронического бактерионосительства. Для постановки иммуноферментного анализа используются полистироловые планшеты и нитроцеллюлозные мембраны (носители).  Иммунные сыворотки в качестве источника антител используют для сенсибилизации носителей, а затем уже наносят антигены (сыворотка крови, моча, смывы и т. д.). ИФА может быть выполнен в течение рабочего дня. Проведение иммуноферментного анализа 1. Проведение ИФА в иммунологических планшетах В лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего разведения моноспецифических антисывороток или моноклональных антител к тому или иному антигену и оставляют при комнатной температуре на 16-18 ч. Затем проводят 2-, 3-кратное по 2 мин отмывание планшеты 0,1М бикарбонатным буфером, содержащим 0,05% твин 20. Все последующие операции проводят при комнатной температуре. В лунки сенсибилизированной планшеты вносят по 100 мкл исследуемых образцов, представляющих собой, как правило, суточную культуру бактериальных клеток, и проводят инкубацию в течении 1 ч при комнатной температуре. После 6-кратного отмывания в течение 30 мин устанавливают специфическую связь с соответствующим антигеном с помощью конъюгата (кроличьи антитела к холероген-анатоксину с пероксидазой хрена). Рабочее разведение конъюгата в 0,1М NaHCO3 с 0,05% твин 20 подбирают эмпирически. Содержимое инкубируют в течение 1 ч и вновь отмывают, как указано выше. Для проявления реакции в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратной смеси (15 мл Na-цитратного буфера pH 5,2 + 7 мг ортофенилендиамина +5 мкл перекиси водорода). Через 15-20 мин реакцию прекращают 6М раствором серной кислоты. 2. Проведение ИФА на нитроцеллюлозных мембранах Для проведения исследования подготавливают полоски нитроцеллюлозной мембраны необходимого размера и раскладывают на столике. После внесения по 1 мкл исследуемого образца мембраны высушивают 3-5 мин на воздухе. Блокировку свободных участков мембраны проводят 0,5%-м желатином в 0,1М NaHCO3с 0,05% твин 20 в течение двух часов при 37oС. После блокировки полоски вносят в рабочий раствор одной из моноспецифических кроличьих антисывороток и инкубируют при 37oС 1 ч. После 6-кратного отмывания полоски вносят в конъюгат козьих антител к IgG кролика с пероксидазой хрена и инкубируют при 37oС 1 ч. После 6-кратного отмывания для проявления реакции мембраны переносят в раствор диаминобензидина (5 мг диаминобензидина - 10 мл 0,5М трис-HCL pH 7,4 +5 мкл перекиси водорода) на 15-20 мин. Реакцию останавливают перенесением полосок в дистиллированную воду. Учет реакции проводят визуально. Источник: http://5fan.info/otrpolbewotrpolaty.html