5. Метод заморожування - відтаювання грунту

Відомо, що мікроорганізми у грунті перебувають у адсорбированном на ґрунтових частинках стані. Для повноти десорбции мікроорганізмів з ґрунтових частинок застосовуються різні методи: хімічні, у яких грунтові зразки обробляють різними детергентами, фізичні, основу яких лежить метод механічного розтирання зразків грунту.

Для кращої десорбции мікроорганізмів з ґрунтових частинок рекомендується використовувати метод заморожування - оттаиванияпочвы. Суть методу ось у чому. Отобранный виділення актиноміцетів зразок грунту міститься у випаровувач побутового холодильника за нормальної температури 8°. Згодом зразок вилучають із холодильника і витримується при кімнатної температурі до відтаювання. Процедуру замораживания-оттаивания повторюють двічі. Потім навішення грунту вміщують у стерильну водопровідну воду, збовтують суспензію протягом 15 хв на кругової качалке при 230 об./хв, після чого різні розведення суспензії висівають на живильне агаровую платівку в чашках Петрі.

Метод заморожування - відтаювання зразків грунту дає змоги виявити у яких в 1,2-3,6 рази більше актиноміцетів, ніж тих ж зразках без заморожування. Це, очевидно, пов'язаний з підвищенням десорбции актиноміцетів із поверхні ґрунтових частинок.

Очищення антибіотика виробляється хроматогра...фическими методами (хроматографія на оксиде алюмінію, целюлозі, ионитах) чи противоточной екстракцією. Очищені антибіотики піддають лиофильной сушінню.

Після виділення антибіотика проводять випробування його чистоти. І тому визначають його елементний склад, фізико-хімічні константи (температуру плавлення, молекулярну масу, адсорбцію в видимої, СФ- і ИК-областях спектра, удільне обертання). Исследуют також антибактеріальну активність, стерильність і токсичність антибіотика.

Токсичність антибіотиків визначають на експериментальних тварин, яким протягом певного періоду внутрішньовенно, внутрибрюшинно, внутримышечно чи шляхом вводять різні дози досліджуваного антибіотика. За відсутності зовнішніх змін - у поведінці тварин за протягом 12-15 сут вважають, що випробовуваний антибіотик не має помітними токсичними властивостями. За більш глибокому дослідженні з'ясовують, чи має даний антибіотик прихованої токсичністю впливає на окремі тканини і органи тварин.

Одночасно досліджують характер біологічного дії антибіотика - бактериостатический чи бактерицидний, що дозволяє прогнозувати механізми його антибактеріальних властивостей.

Наступний етап вивчення антибіотика - оцінка його терапевтичних властивостей. Экспериментальных тварин заражають певним виглядом патогенного мікроба. Мінімальна кількість антибіотика, предохраняющее тваринного від смертельної дози інфекції, мінімальна терапевтичної дозою. Чим більший ставлення токсичною дози антибіотика до терапевтичної, тим більша терапевтичний індекс. Якщо терапевтична доза дорівнює токсичного чи наближається до неї (низький терапевтичний індекс), то ймовірність застосування антибіотика в лікувальної практиці обмежена або зовсім неможлива.

У разі, коли антибіотик входить у широку медичну практику, розробляють промислові методи його одержання і докладно вивчають його хімічну структуру.

Стандартизация антибіотиків. За одиницю антибиотической активності приймають мінімум антибіотика, здатне придушити розвиток чи затримати зростання стандартного штами тест-микроба у певному обсязі живильне середовище. Значимість біологічну активність антибіотиків висловлюють зазвичай, у умовних одиницях дози (ЕД), які у 1 мл розчину (ЕД/мл) чи 1 мг препарату (ЕД/мг). Наприклад, за одиницю антибиотической активності пеніциліну прийнято вважати мінімум препарату, здатне затримувати зростання золотавого стафилоккока стандартного штами 209 в 50 мл живильного бульйону. Для стрептоміцину за одиницю активності прийнято вважати мінімум антибіотика, затримуюче зростання Є. coli один мл живильного бульйону.

Коли багато антибіотики були отримані чистому вигляді, декого з них стали висловлювати біологічну активність в масових одиницях. Наприклад, встановлено, що 1 мг чистого підстави стрептоміцину еквівалентний 1000 ЕД. Отже, 1 ЕД активності стрептоміцину еквівалентна 1 мкг чистого ...підстави цього антибіотика. Тож у зараз у вона найчастіше кількість стрептоміцину висловлюють в мкг/мг чи мкг/мл. Чим ближче до число мкг/мг в препаратах стрептоміцину до 1000, тим, отже, чистіше препарат.

Зрозуміло, що одиниця біологічну активність антибіотика який завжди збігаються з 1 мкг. Наприклад, для бензилпенициллина 1 ЕД еквівалентна приблизно 0,6 мкг, оскільки 1 мг антибіотика містить 1667 ЕД.

Методи аналізу антибіотиків. На відміну від деяких інших природних сполук (алкалоїди, гликозиды) для антибіотиків немає загальних групових реакцій. Такі реакції можна використовувати лише антибіотиків одного хімічного класу, наприклад для тетрациклинов чи нит-рофенилалкиламинов (левомицетинов).

Для ідентифікації антибіотиків можна використовувати різні кольорові реакцію відповідні функціональні групи; спектральні характеристики в видимої, СФ- і ИК-областях спектра; хроматографічні методи.

Для кількісного визначення антибіотиків використовують біологічні, хімічні, фізико-хімічні методи.

Біологічні методи засновані на безпосередньому біологічному дії антибіотика на застосовуваний тест-организм, чутливий до цього антибіотика. Применяемый у своїй дифузний метод грунтується на здібності молекул антибіотиків дифундувати в агаровых середовищах. Оцінюється розмір зони, у якій використовувані тест-организмы не розвиваються. Цей розмір залежить від хімічної природи антибіотика, його концентрації, рН і складу середовища, температури експерименту.

У основі інший різновиду біологічного тестування лежить турби-диметрия - метод кількісного аналізу за інтенсивністю світла, поглиненої зваженими частинками - клітинами мікроорганізмів. При додаванні певних кількостей антибіотиків спостерігається затримка зростання клітин мікроорганізмів (бактериостатический ефект), та був їх загибель (бактерицидний ефект). У цьому змінюється (зменшується) інтенсивність поглиненої світла. Як альтернативного турбидиметрии методу можна використовувати нефелометрический метод кількісного аналізу за інтенсивністю світла, розсіяного мікроорганізмами.

Для кількісного визначення антибіотиків використовують різноманітні спектральні методи - насамперед, фотоколориметрический і спект-рофотометрические методи. Наприклад, визначення концентрації розчину еритроміцину можна застосувати фотоколориметрический метод, заснований на зміні абсорбції розчину антибіотика після взаємодії його з сірчаної кислотою. Антибіотики тетрациклинового низки можуть визначити спектрофотометрическим методом по смузі поглинання, зникаючої після лужного гідролізу чинного речовини.

Розроблено спосіб, який поєднає фізико-хімічний і біологічний підходи для оцінювання активності ЛЗ. Метод грунтується на лазерної дифракції серед, що містить клітини мікроорганізмів при дії ними хімічних речовин, зокрема антибіотиків

...Збереження штамів продуцентів антибіотиків в активному стані

Важливе значення для промислового отримання антибіотиків, і навіть для лабораторних досліджень продуцентів антибиотических речовин мають методи підтримки життєздатності організмів, дозволяють зберегти їх антибиотическую активність постійному рівні.

Відомо, що мікроорганізми і особливо актиномицеты легко змінюються при звичайних методах їх збереження. До того ж частенько у своїй спостерігається повна чи часткова втрата антибиотических властивостей.

Втрата антибиотических властивостей залежить, очевидно, від цього, що ми вміємо у звичайних обставинах культивування створити такі умови, які б збереженню організмом його основних фізіологічних особливостей. Нерідко втрата активності спостерігається при культивуванні мікроорганізмів на багатих за складом середовищах і за частих пересевах.

Разом про те зміна фізіологічних чи біохімічних властивостей продуцентів антибиотических речовин може визначатися, їх генетичними закономірностями. Відомо, наприклад, що продуцент грамицидина З у розвитку диссоциирует на цілий ряд варіантів, деякі з них не утворюють цей антибіотик. Причому процес дисоціації культури іде у напрямі освіти у велику кількість біологічно неактивних варіантів, що в результаті призводить до втрати культурою здібності освіти грамицидина.

Нині використовується ряд методів збереження культур продуцентів антибіотиків, який би їх тривале перебування на активному стані. У основу цих методів покладено принцип затримки розвитку мікроорганізмів, принцип консервації. До кожного виду продуцента антибиотических речовин може бути підібрали свій, найбільше підходить метод консервування, дозволяє зберегти культури у активному стані протягом щодо багато часу.

Найпоширенішими методами збереження культур микроорганизмов-продуцентов антибіотиків в активному стані є такі.

Лиофилизация культур. Збереження вегетативних клітин чи суперечка організмів у стерильною грунті, стерильному піску чи насінні деяких рослин (наприклад, просі). За даними авторів, культури актиноміцетів, що у стерильною грунті, зберігають життєздатність за тридцяти років і більше. Збереження суперечку вирішено на вигляді водних суспензий в запаяних ампулах.

4. Збереження суперечку вирішено на стерильному кварцовому піску.

. Збереження культур на агаровом косячке під мінеральним олією.

6. Збереження культур при низьких температурах (+4, +5°С).

. Останнім часом задля збереження різних мікроорганізмів в активному стані використовують рідкий азот, куди завадять відмиту від середовища суспензію клітин. Іноді в газоподібної фазі рідкого азоту зберігають культури актиноміцетів,... що перебувають у агаровых блочках, вирізані з агаровой платівки в чашках Петрі.

Найкращою формою збереження організмів, коли він немає втрати антибиотической активності, був частиною їхнього лиофилизация - метод придатний як спорообразующнх, це у для бесспоровых культур мікроорганізмів. Сутність цього у тому, що суспензія клітин чи суперечка мікроорганізму, приготовлений на середовищі, багатою білками (часто використовується цих цілей кров'яна сироватка), швидко заморожується за нормальної температури від - 40 до - 60°С і висушується під вакуумом до залишкової вологості (0,5-0,7%). Після такого обробки ампули із суперечками чи клітинами лиофнлизированного мікроба запаюють. Лиофилизированные форми бактерій можуть зберігатися протягом 16-18 років, суперечки грибів не втрачають основних властивостей при зберіганні в лиофилизированном вигляді у протягом 10 років.