13. Основные принципы и методы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и размножение. Классификация питательных сред и требования, предъявляемые к ним.

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов – риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 С в течение 1-2сут. Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах – анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительный потенциал.

Среды различают по консистенции (жидкие, полужидкие, легкие), по составу (простые, сложные), по целевому назначению(основные, консервирующие, транспортные, накопительные, селективные, дифференциально-диагностические, специальные-обогащенные).

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные(МПА, МПБ), дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава.

В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

14. Бактериологический метод исследования, его этапы..

Бактериологическое исследование основано на выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, принадлежащих к одному виду, выделенных на питательной среде.

Выделение чистой культуры позволяет определить морфологические, культуральные, биохимические и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая принадлежность возбудителя, т. Е. осуществляется его идентификация.

Выбор метода культивирования, состава питательной среды зависит, главным образом, от типа питания и дыхания микроорганизмов. Выделение чистой культуры

Первый день: Второй день

Микроскопия исследу- 3. Изучение культуральных

емого материала. Свойств.

Посев исследуемого ма- 4. Пересев колоний на плот-

териала на питательные среды (плотную, ные питательные среды

жидкую). Культуры.

Идентификация чистой культуры

Третий день Четвёртый

1. Проверка чистоты вы- Изучение фагочустви-

деленной культуры. тельности, фагоцитирова-

2. Изучение биохимиче- ния, колициногенности

ских свойств: а) сахаро- чувствительности к анти-

литических; б) протео- биотикам и других

литических. свойств.

3. Определение антигенных свойств. Выделение и идентификация чистой

Культуры аэробных бактерий

Первый день. Из исследуемого материала готовят мазки и микроскопируют, затем сеют его на плотную среду в чашки Петри шпателем или бактериологической петлей. Чашки с посевами помещают в термостат на 18-24 ч. При температуре 37 С.

Второй день. После суточной инкубации чашек посевами в термостате изучают культуральные свойства бактерий (характер из роста на плотных и жидких питательных средах).

Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете.

Микроскопическое изучение колоний.

Из части колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии однородных бактерий остаток колоний пересевают на скошенный агар для получения в достаточном количестве чистой культуры. Пробирки с посевами помещают в термостат на 18 – 24 ч при температуре 37 С.

Третий день.Из выросшей на скошенном агаре культуры делают мазки, окрашивают по Граму. О чистоте культуры судят по однородности роста, формы, размера и окраски микроорганизмов. Для идентификации выделенной чистой культуры кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей микроорганизмов необходимо определить их ферментативные и антигенные свойства, фаго- и бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки, характеризующие их видовую специфичность.

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы, используют среды Гисса.Протеолитические ферменты у бактерий обнаруживают с помощью посева их в столбик желатина.

Показателями более глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода и других соединений. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы микроорганизмов в МПБ или 1% пептонную воду. Посевы выдерживают в термостате в течение 24 – 72 ч.

Антигенные свойства выделенной культуры изучают с помощью реакции агглютинации.

Вирулентность определят путем заражения эксперементальных животных.

Видовую принадлежность аэробных бактерий определяют путем сравнения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

16. Царство вирусов. Классификация. Морфология и строение вирионов. Химический состав, функции структурных элементов. Прионы. Вироиды. Работы Д.И.Ивановского.Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства: рибовирусы и дезоксирибовирусы. Все вирусы подразделяют на две большие группы: ДНК-содержащие вирусы (дезоксивирусы) и РНК-содержащие вирусы (рибовирусы). Затем каждую из этих групп подразделяют на вирусы с двухнитчатой и однонитчатой нуклеиновыми кислотами. Следующий критерий - тип симметрии вирионов (зависит от способа укладки капсомеров), наличие или отсутствие внешних оболочек и т.п.Вирусы - это мельчайшие микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопротеид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой – капсидом. Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах; они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую, сперматозоидную. Вирусы состоят из следующих основных компонентов:1. Сердцевина - генетический материал (ДНК либо РНК), который несет информацию о нескольких типах белков, необходимых для образования нового вируса.2. Белковая оболочка, которую называют капсидом. Она часто построена из идентичных повторяющихся субъединиц - капсомеров. Капсомеры образуют структуры с высокой степенью симметрии.3. Дополнительная липопротеидная оболочка. Она образована из плазматической мембраны клетки-хозяина и встречается только у сравнительно больших вирусов (грипп, герпес).Капсид и дополнительная оболочка несут защитные функции, как бы оберегая нуклеиновую кислоту. Кроме того, они способствуют проникновению вируса в клетку. Полностью сформированный вирус называется вирионом.Химический состав вирионовВирусные ДНК. По структуре различают двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную и кольцевую формы. В каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, но на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180º) повторы. Нуклеотидные повторы являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.Вирусная РНК. Вирусные РНК могут быть однонитевыми и двунитевыми. При этом РНК может быть линейной и кольцевой. Однонитевые РНК по функции делятся на 2 группы: плюс-нить («+», позитивный геном) – Рнк, способные транслировать закодированную в ней информацию на рибосомы клетки-хозяина, т.е. выполнять функцию иРНК; минус-нить (« - », негативный геном) – вирусные одноцепочечные РНК, служащие матрицей для образования иРНК. У двунитевых как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана в одной цепи.Вирусные белки, подразделяются на структурные и функциональные. Первые входят в состав вирусного капсида, которые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репродукции вирусов. Структурные белки у простых вирионов представлены капсидными белками, которые защищают нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их состав входят белки, несущие «адресную» функцию, заключающуюся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. У сложных вирионов капсидные белки выполняют также защитную функцию. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных ДНК и РНК. Имеются также внутренние гистоноподобные белки, обладающие антигенными свойствами. Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. Липидный и углеводный состав вириона определяется клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками.Ферменты вирусов. Вирусы содержат в составе капсида одну или две группы ферментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрипции , ко второй – ферменты, участвующие в проникновении вирусной унклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов. Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. Прио́ны — особый класс инфекционных агентов, чисто белковых, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных.Вироиды — это патогены растений, которые состоят из короткого фрагмента (несколько сотен нуклеотидов) высококомплементарной, кольцевой, одноцепочечной РНК, не покрытой белковой оболочкой.Впервые существование вируса (как нового типа возбудителя болезней) доказал в 1892 году русский учёный Д. И. Ивановский. После многолетних исследований заболеваний табачных растений, в работе, Д. И. Ивановский приходит к выводу, что мозаичная болезнь табака вызывается «бактериями, проходящими через фильтр Шамберлана, которые, однако, не способны расти на искусственных субстратах».Пять лет спустя, при изучении заболеваний крупного рогатого скота, а именно - ящура, был выделен аналогичный фильтрующийся микроорганизм. А в 1898 году, при воспроизведении опытов Д. Ивановского голландским ботаником М. Бейеринком, он назвал такие микроорганизмы «фильтрующимися вирусами». В сокращённом виде, это название и стало обозначать данную группу микроорганизмов.

17. Механизмы взаимодествия вирусов с соматической клеткой. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжает после их проникновения внутрь клетки. В результате развивается: продуктивная форма – происходит размножение, репродукция вируса, абортивная форма – ее нарушение на одном из этапов, интегративная форма – интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном.Продуктивная инфекция. Стадии1. Адсорбция – прикрепление вириона к клеточным рецепторам. Рецепторами вирусов являются прикрепительные белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нити или шипа.2. Проникновение вируса в клетку хозяина. Пути:- рецепторно-опосредованный эндоцитоз – с помощью белков-клатринов образуются окаймленные пузырьки- виропексис – заключается в слиянии мембраны вирусного капсида с клеточной или ядерной мембраной с помощью F-белка суперкапсида. В результате капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид сбелком встраивается в ее плазматическую мембрану.-фагоцитоз- вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу.3. Транспорт вируса внутри клетки – вирус с помощью мембранных внутриклеточных пузырьков переносится на рибосомы, ЭПС или в ядро.4. «Раздевание» вириона – заключается в их освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты.5. Эклипс-фаза – вирион не обнаруживается при электронной микроскопии. Происходит репродукция вириона. Она носит дезъюнктивный характер, т.е. компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки. Стадия начинается с транскрипции и репликации вирусного генома. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит по триаде ДНК – иРНК – белок, но различие касается фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осуществляется несколькими путями.1. Вирусы с негативным геномом имеют в своем составе вирусспецифичекую РНК-полимеразу или транскриптазу. Они синтезируют иРНК на матрице геномной РНК. Фермент содержится как в составе однонитевых, так и двунитевых РНК-содержащих вирусов.2. У вирусов с положительным геномом функцию иРНК выполняет сам геном, который транслирует содержащуюся в нем информацию на рибосомы клетки хозяина.3. У РНК-содержащих ретровирусов в составе имеется обратная транскриптаза, которая способна переписывать информацию с РНК на ДНК– обратная транскрипция.6. Сборка вириона – состоит в образовании нуклеокапсидов Синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков в клетке происходит на разных структурах, но вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом.7. Выход вирусных частиц из клетки - происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования.Интегративная (встраивающаяся) инфекция. Биологический смысл заключается в сохранении вирусной информации в составе клеточного генома и ее передаче потомству.Вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. Место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющимися в дНк сайтах при участии рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз. Вирус, интегрированный в клеточный геном, называют провирусом. Провирус может реплицироваться в составе клеточного генома пропорционально делению клетки. С увеличением числа копий провируса без его выщепления из клеточного генома может привести к встраиванию провируса в другую хромосому. Вщепление провируса и его проникновение в новую клетку может вызвать продуктивную инфекцию.У РНК-содержащих вирусов включение РНК в клеточный геном происходит путем обратной транскрипции. Сначала при помощи транскриптазы на матрице РНК образуется ДНК-транскрипт. Транскрипт является матрицей для образования второй нити. Затем двунитевой ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном (вирогения). В интегрированном состоянии вирусная ДНК может транскрибироваться в составе клеточного генома при участии клеточных РНК-полимераз.

21. Материальные основы наследственности микроорганизмов. Организация генетического материала у прокариотов, эукариотов, вирусов. Генотип и фенотип. Виды изменчивости. Модификации. Механизм. Фенотипические проявления.

Огромное значение в становлении и развитии молекулярной ге­нетики имел выбор бактерий и вирусов в качестве основных модель­ных систем для изучения общегенетических закономерностей. Упо­мянутые микроорганизмы в отличие от такого классического объек­та, как мушка дрозофила, обладают уникальными для генетических экспериментов свойствами.

1. Гаплоидностью, т.е. наличием одной хромосомы, что устраняет явление доминантности.

2. Высокой скоростью размножения обеспечивающей получение в лабораторных условиях многомиллиардных популяций в течение нескольких часов.3. Высокой разрешающей способностью методов генетического анализа бактерий и вирусов, позволяющей обнаружить их мутанты с частотой 1(Г⁹ и ниже.

4. Половой дифференциацией, заключающейся в существовании донорных и реципиентных бактериальных клеток, соответственно отдающих или воспринимающих генетическую информацию.5. Наличием у бактерий обособленных фрагментов ДНК — плаз-мид, транспозонов и Is-последовательностей.

Современные достижения молекулярной генетики связаны также с разработкой методов генной инженерии — изолирования и перено­са отдельных генов из одних клеток прокариот или эукариот в дру­гие. Это создало поистине фантастические перспективы для получе­ния ранее неизвестных генотипов, прежде всего среди бактерий и вирусов, и заложило основу новейшей биотехнологии производства вакцин, интерферона, гормонов и других биологически активных веществ.Следующий этап в развитии медицинской микробиологии связан с открытием молекулярно-генетических закономерностей формирова­ния новых разновидностей и видов патогенных микроорганизмов. Это даст возможность прогнозировать их появление и распространение

среди населения разных регионов нашей планеты и своевременно про­водить соответствующие противоэпидемические мероприятия.

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ. ГЕНОТИП, ФЕНОТИП БАКТЕРИЙ И ГЕНОФОНД ИХ ПОПУЛЯЦИЙ

Материальной основой наследственности, определяющей ге­нетические свойства всех организмов, в том числе бактерий и виру­сов, является ДНК. Исключение составляют только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК. Од­нако в отличие от хромосомы эукариот гены прокариот организованы в более простую структуру, представляющую собой молекулу ДНК, часто замкнутую в кольцо. Молекулярная масса ДНК у бактерий срав­нительно велика: у Е. coli она равна 2 · 10⁹.

Наряду с описанной структурой, называемой бактериальной хро­мосомой, или нуклеоидом, генетический материал у бактерий содер­жится во внехромосомных генетических элементах — плазмидах, которые могут находиться в автономном состоянии в цитоплазме клетки.

Гены, ответственные за синтез того или иного соединения, при­нято обозначать строчными буквами латинского алфавита, соответ­ствующими названию данного соединения со знаком «+». Например, his* — гистидиновый ген, lеи⁺* — лейциновый ген и т.д. Гены, кон­тролирующие резистентность к лекарственным препаратам, фагам, ядам, обозначают буквой г (resistent— резистентный). Например, резистентность к стрептомицину записывается знаком str¹, а чувстви­тельность str*. Фенотип бактерий обозначают теми же знаками, что и генотип, но с прописной буквы.

Генотип микроорганизмов представлен совокупностью генов, определяющих его потенциальную способность к фенотипическому выражению записанной в них информации в виде определенных при­знаков. Условия окружающей среды способствуют проявлению (экс­прессии) генов или, наоборот, подавляют их функциональную актив­ность, выраженную в образовании определенных ферментов. У бак­терий, имеющих определенный набор генов, функцию каждого из них определяют не прямым, а косвенным путем на основании изменения или утраты соответствующего признака при утрате какого-либо уча­стка ДНК. Таким образом, заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения признака присущего исходному генотипу и штамму с мутировавшим геном. В генетичес­ких исследованиях мутировавшие гены служат маркерами, которые дают возможность судить об их передаче и функционирова­нии. Сцепленность таких маркеров с другими генами устанавливает­ся путем их передачи от донорных к реципиентным клеткам в опы­тах трансформации трансдукции и конъюгации. Это позволяет уста­новить их локализацию на бактериальной хромосоме и составить генетическую карту .

МОДИФИКАЦИИ

Фенотипические изменения какого-либо признака или не­скольких признаков микроорганизма называют модификациями. В отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вско­ре утрачиваются.

Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных мик­робных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. Такого рода изменчивость позволяет микробным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде и сохранять на должном уровне свою жизнеспособность.

Модификации проявляются в изменении морфологических, био­химических и многих других признаков с последующей их реверси­ей к первоначальному фенотипу после устранения действия фактора, вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохра­нении данной модификации.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответ­ствующих структурных генов, контролируемых регуляторными гена­ми. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафило­кокки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, раз­рушающий данный антибиотик.

К модификациям можно отнести включение «молчащих» генов (без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного за­болевания.

К модификациям можно отнести также запрограммированные из­менения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определен­ные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Суще­ствует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приво­дит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы си­филиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона.

Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образующиеся при этом L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. При выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактерио-статическими концентрациями антисептиков также можно получить их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или других признаков.

22.Мигрирующие генетические элементы бактерий: транспозоны, Is-последовательности , плазмиды. Характеристика. Свойства плазмид. Роль плазмид в детерминировании патогенных признаков и лекарственной устойчивости.Внехромосомные факторы непосредственно входят в сосотав микроорганизмов. Они представлены пламидами, транспозонами и Is-последовательностями, которые являются молекулами ДНК, отличающимися молекулярной массой,Объемом закодированной информации, способности к автономной репликации. Плазмиды, транспозоны и Is-последовательности не являются генетическими элементами. Жизненно-необходимыми для бактерий, так как они не несут информации о ситезе ферментов. Участвующих в пластическом или энергетическом обмене. Вместе стем. Они могут придавать бактериям определенные селективные преимущества( резистентность к а/б). Плазмиды либо не связаны с хромосомой,либо встроены в ее состав. Автономное состояние- сами реплицируются. Транспозоны и Is-последовательности всегда связаны с хромосоиой и не способны к самостоятельной репликации.Транспозоны-нуклеотидные последовательности(2000 до 20 500 пар нуклеотидов). Которые несут генетическую информацию. Необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликации. А при перемещении- делеции и инверсии. Транспозоны могут находится в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы.Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона ( хромосомная ДнК) на другой( плазмида) и наоборот. Кроме того они выполняют регуляторную и кодирующую функции, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов, разрушающих а/б.. Транспозоны имеют концевые структуры. Которые являются маркерами, позволяющих отличать их от других фрагментов ДНК.Is-последовательности- фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов, в них содержится информация. Необходимая только для их транспозиции, т.е. перемещение в различные участки ДНК .Функции:1.Координировать взаимодействие транспозонов ,плазмид, и умеренных фагов. Как между собой так и с хромосомой; 2.вызывать инактивацию гена, в котором произошла интеграция Is-последовательности( вкл. Гена), либо будучи встроенным в хромосому, служить промотором. Который вкл или выкл. Транскрипцию генов, выполняя регуляторную функцию; 3 Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликацииВ свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены- неспособномсть реплицировать самостоятельно.Плазмиды несут 2 функции- регулторную и кодирующую. Первая- в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома,не способного к репликации его ф-я восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодрующая ф-я состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации,о которой судят по прирбретенному признаку, например образованию пилей(F- плазмида), резистентности к а/б. Переход плазмида в автономное состояние и реализация записанной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как Is-последовательностей и транспозонов – в любой участок.F- плазмида или половой фактор, представляет собой циркулярно замкнутую нить ДНК. Контролирует синтез половых ворсинок, которые способствуют эффективному спариванию бактерий- доноров с реципиентными клетками при конъюгации.R-плазмиды-определяет устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарственным препаратам. передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распростронению среды патогенных и условно- патогенных бактерий, ч то чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний.Они имеют сложное молекулярное строение, в их состав входят:r- ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы- Is-последовательности, транспозоны и tra-опероны.R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к какому либо а/б, контролирует синтез фермента, вызывающего его инактивацию или модификацию. В одном таком гене может содержатся несколько транспозонов.tra-оперон обеспечивает конъюгативность плазмиды, входит в состав R-плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды,которые могут передаватся от одной бактерии к другой путем трансдукции.Плазмиды патогенности- контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование.Бактериоциногенные плазмиды- контролируют синтез рода а/б веществ- бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов.они обнаружены в кишечных бактериях(колицины), бактерий чумы( пестицины),холерных вибрионов( вибриоцины). Колицины энтеробактерий представляют собой вещества белковой природы.Механизм бактерицидного действия неодинаков. Показано. Что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов(Е3) нарушает ф-ю рибосом, другой(Е2) является ферментом- эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий. Колициногеные плазмиды находятся в клетках энтеробактерий в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой Плазмиды биодеградации-несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии. Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий,обеспечивая селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека.

Плазмиды

Плазмиды несут две функции — регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений ме­таболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плаз­миды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации его функция восстанавливается за счет плазмидного реп-ликона.

Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактери­альную клетку новой информации, о которой судят по приобретенно­му признаку, например образованию пилей (F-плазмида), резистент­ности к антибиотикам (R-плазмида), выделению бактериоцинов (Col-плазмида) и т.д.

Переход плазмиды в автономное состояние и реализация запи­санной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздей­ствиями внешней среды. В некоторых случаях продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию несущих их бактерий. Само­стоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохране­нию и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, так же как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактери­альной хромосомы, в то время как Is-последовательностей и транс­позонов — в любой ее участок.

В настоящее время описано свыше двух десятков плазмид, из которых будут рассмотрены следующие.

F-плазмида, или половой фактор, представляет собой циркуляр-но замкнутую нить ДНК с молекулярной массой 60 • 10⁶. Она контро­лирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способству­ют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Данная плазмида реплицируется в незави­симом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клет­ки бактерий-реципиентов.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F-плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим ее конъюгативность. F-плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав последнюю некоторыми веществами, например акридиновым оранжевым, в результате чего клетки теряют свойства донора. Сравнительно легкая элиминация и очень быстрая и эффек­тивная передача F-плазмиды реципиентным клеткам дали основание считать, что она располагается в цитоплазме бактерий вне хромосо­мы. Однако F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромо­сому и находиться с ней в интегрированном состоянии.

R-плазмиды. Известно большое количество R-плазмнд, опреде­ляющих устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарствен­ным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к Другим привела к их широкому распространению среди патогенных и услов­но-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний.

R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входят: г-ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы — Is-последовательности, транспозоны и fra-опероны.

R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к какому-либо антибиотику, контролирует синтез фермента, вызывающего его инак­тивацию или модификацию. Значительное число г-генов является транспозонами, которые могут перемещаться от плазмиды-носителя в другие репликоны. В одном г-гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным ан­тибиотикам. Этим объясняется множественная лекарственная резис­тентность бактерий.

Тгд-оперон, обеспечивающий конъюгативность плазмиды, входит в состав R-плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположитель-ные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, ко­торые могут передаваться от одной бактерии к другой путем транс-дукции.

Плазмиды патогенности. Данные плазмиды контролируют ви­рулентные свойства бактерий и токсинообразование. Они будут опи­саны в части «Учение об инфекции».

Бактериоциногенные плазмиды контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ — бактериоцинов, способ* ных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бак-териоцины обнаружены у кишечных бактерий (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилокок­ков (стафилоцины) и др. Наиболее изучены колицины, продуцируе­мые кишечными палочками, шигеллами и некоторыми другими энте-робактериями.

Колицины энтеробактерий (продуцируемые под контролем колици-ногенных плазмид) представляют собой вещества белковой природы. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физи­ко-химическим и антигенным свойствам и по способности адсорбировать на определенных участках поверхности бактериальных клеток.

обозначаются латинскими буквами А, В,С D E1 Е2 К итд,

При обычных условиях культивирования и большинстве клеток баяериапьной популяции, содержащей колициногенные особи, синтеза нзлишша не происходит. Примерно в одной из 1000 клеток отмечается так называемая спонтанная продукция колицина. Однако количество шщинпродуцирующих клеток может быть резко увеличено при об­работке бактерий УФ-лучами и некоторыми другими агентами. При этом погибают только сами клетки, продуцирующие колицины. В то же время бактериальные клетки, несущие Col-плазмиды, резистентны к действию гомологического колицина так же, как и лизогенные бакте­рии к действию гомологического фага. Таким образом, характерной чертой Coi-плазмид является потенциальная летальность для клеток-продуцентов, которая сближает их с профагами (см. 5.4^

Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. По­казано, то) после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бак­терий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой (Е2) является ферментом — эндодезоксирибонуклеазой. Имеются шицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий.

Колициногенные (Col) плазмиды находятся в клетках энтеробак­терий в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой. Однако некоторые из них (ColV, ColB) могут встраиваться в бактериальную хромосому и находиться в ней в ин­тегрированном состоянии. Они, так же как и F-плазмиды, передают­ся путем конъюгации в реципиентные клетки, благодаря имеющему­ся у них fra-оперону.

Широкое распространение бактериоциногении среди микрофло­ры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влияющих на формирование микробных биоценозов. Вме­сте с тем колицины, продуцируемые кишечной палочкой — нормаль­ным обитателем кишечника, могут губительно действовать на пато­генные энтеробактерий, попавшие в кишечник, способствуя тем са­мым нормализации его естественного микробиоценоза.

Способность продуцировать различные типы колицинов исполь­зуется для типирования бактерий с целью эпидемиологического ана­лиза вызываемых ими заболеваний. Такое типирование осуществля­ется путем определения типа Col-плазмиды (колициногено-типирование) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями (колицинотипирование), выделенными от больных, контактирующих с ними лиц, а также из окружающей среды,

Плазмиды биодеградации. Данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бакте­рии используют в качестве источников углевода и энергии. Они мо­гут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества во время пребывания в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологичес­кие штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины.

Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряда Сахаров (лактоза, сахароза, рафиноза и др.) и образовании протеоли-тических ферментов.

Транспозоны

Транспозоны представляют собой нуклеотидные последова­тельности, включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиция! При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дупликяе ции, а при перемещении — делеции и инверсии. Транспозоны могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, ШЙ способной к репликации. Она реплицируется только в составе бакте­риальной хромосомы. При этом новые копии транспозонов могут миг*-рировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популя­ции. Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомна! ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Кроме того, некоторые транс­позоны, так же как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодиру­ющую функции. В частности, они могут нести информацию для син­теза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики.

Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить их не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных живот­ных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с про-вирусами , находящимися в составе их хромосом.

Is-последовательности

Is-последовательности (англ. insertion — вставка, sequence — последовательность) представляют собой транспозируемые элемен­ты, которые также называются «вставки последовательностей осно­ваний». Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более.

В Is-последовательностях содержится информация, необходима! только для их транспозиции, т.е. перемещения в различные участки ДНК.

Вследствие такого рода перемещений ^последовательности мо­гут выполнять ряд функций.

1. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и уме­ренных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной

клетки и обеспечивать их рекомбинацию.

2. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция

Is-последовательности («выключение» гена), либо, будучи встроен­ными в определенном положении в бактериальную хромосому, слу­жить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию под­лежащих структурных генов бактерий-реципиентов), который вклю­чает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию.

3. Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при пере­мещении и дупликации в 5-9 парах нуклеотидов при включении в бактериальную хромосому.

В свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены, что свидетельствует об их неспособности реплицироваться само­стоятельно.