3.2. Процесс размораживания спермы Все оборудование, используемое для размораживания спермы и приготовления спермодоз, следует готовить заранее, до начала процедуры размораживания.

Сперму необходимо как можно быстрее перенести из криогенной емкости непосредственно в Размораживатель (водяную баню).

Не размораживайте более 2-3 соломинок по 0,5 мл одновременно. Следуйте инструкциям поставшика спермы относительно количества соломинок, необходимых на 1 дозу для искусственного осеменения (6-12 соломинок/доза).

Рекомендации по размораживанию: • соломинки 0,5 мл: Размораживать на водяной бане при +37°С в течение 20 секунд (время, необходимое для прогревания спермы до температуры +26°С). Следите, чтобы время не превышало 20 секунд. • Макросоломинки объемом 5,0 мл: Размораживать на водяной бане при +50°С в течение 45 секунд. Насухо протрите соломинки чистым бумажным полотенцем. Встряхните соломинку, чтобы пузырек воздуха передвинулся к запаянному кончику, который нужно обрезать. Держите соломинку вертикально (пузырьком воздуха вверх) и откупоривайте соломинку, отрезая ее конец чистыми ножницами или ножом для соломинок. Избегайте непосредственного контакта спермы с режущим инструментом. Опорожните открытую соломинку в предварительно прогретый тюбик (+26°С), протолкнув хлопковую пробку или шарик для укупоривания при помощи наконечника в сторону открытого кончика, для переноса спермы в тюбик.

Повторяйте эти шаги до тех пор, пока в тюбике не окажется необходимый объем спермодозы. Дозы для искусственного осеменения содержат в целом по 4 млрд. спермисв. Это соответствует 8 соломинкам по 0,5 мл или одной макросоломинке объемом 5 мл.

Размороженную сперму доводят до объема конечной дозы 60-70 мл добавлением дополнительного количества разбавителя, предварительно подогретого до 26°С.

Запечатайте тюбик со спермой, используя зажим или термическую герметизацию.

Опытные техники могут размораживать соломинки объемом 0,5 мл при +50°С в течение 15 секунд. Эта процедура несколько улучшает качество размороженной спермы. Однако следует внимательно контролировать время размораживания и температуру, чтобы избежать повреждения спермиев.

3.3. Оценка подвижности размороженной спермы Возьмите 1 мкл разведенной спермы. Поместите ее на предварительно подогретое (+37°С) предметное стекло, накрытое покровным стеклом, и проведите оценку подвижности. Используйте фазово-контрастный микроскоп с нагревательным столиком. Для точной оценки подвижности следует обеспечить температуру предметных и покровных стекол или счетных камер на уровне +37°С.

Наиболее объективную оценку спермы дает использование Sperm Vision® производства фирмы Минитюб (Германия).

4. Осеменение размороженой спермой Поскольку жизнеспособность спермиев после размораживания "короткая", то спермодозы следует использовать для осеменения в течение 20 минут после размораживания. Успех программы искусственного осеменения размороженной спермой в значительной степени зависит от качественно проведенного процесса осеменения.

51. Естественное осеменение у пчел

52. Искусственное осеменение пчелиных маток

53. Визуальная и микроскопическая оценка спермы. Методика исследований

После оценки свежеполученной спермы по внешним признакам производят микроскопическую оценку по густоте, подвижности и концентрации спермиев, определение процента живых и мертвых спермиев, уродливых (патологических) форм. Оценка спермы по густоте. По густоте оценивают только свежеполученную сперму. Различают сперму густую — ее обозначают буквой I, среднюю — С, редкую — Р. Оценка по густоте производится под микроскопом методом раздавленной капли под увеличением в 120— 280 раз. Густая сперма — все поле зрения микроскопа заполнено спермпями, между ними едва заметны незначительные промежутки. В густой сперме содержится свыше 1 млрд. спермиев в 1 мл. Средняя сперма — между отдельными спермиями наблюдаются промежутки, примерно равные длине спермия. В такой сперме содержится от 400 млн до 1 млрд. спермиев. Редкая сперма — промежутки между спермиями превышают длину одного спермия, в такой сперме меньше 400 млн. спермиев в 1 мл. Отсутствие спермиев-аспермия обозначается буквой А, незначительное их количество олигоспермия — О. Допускается к использованию при искусственном осеменении сперма барана густая, быка густая и средняя. Сперма жеребца и хряка значительно разбавлена секретами придаточных половых желез и по сравнению со спермой барана и быка будет редкой, по количеству спермиев содержит: густая более 0,2 млрд, средняя от 0,1 до 0,2 млрд и редкая менее 0,1 млрд в 1 мл спермы. Определение концентрации спермиев в сперме. Глазомерная оценка спермы по густоте дает приблизительное представление о фактическое количестве спермиев в 1 мл спермы, что не обеспечивает рационального использования ее, не позволяет установить с большой точностью степень разбавления, а следовательно, нормировать количество спермиев в дозе. Для точного определения количества спермиев в единице объема и в эякуляте пользуются методом прямого подсчета в счетных камерах с сетками Горяева, Бюркера, Тома и др., принцип устройства которых в основном одинаков. Камеры представляют собой продольные пластинки толстостенного стекла, в середине которых поперечные желобки образуют три площадки, средняя из них на 0,1 мм ниже крайних. В камере с сеткой Горяева средняя площадка разделена на две половины. На каждой половине нанесена сетка, состоящая из 225 больших квадратов, из них 25 (по 5 в ряду) дополнительными линиями разделены на 16 малых квадратиков каждый. Камеры других систем имеют иную штриховку, однако площадь малого квадратика у всех одинакова — 1/400 мм2. После притирки покровного шлифованного стекла до появления радужных колец над сеткой образуется капиллярная полость высотой 0,1 мм. Следовательно, объем над одним малым квадратиком составляет 1/4000 мм3. Перед зарядкой камеры сперму разбавляют 3%-ным раствором поваренной соли или дистиллированной водой. Разбавитель одновременно убивает спермиев, они становятся неподвижными. Разбавление проводят в эритроцитарных (сперма быка и барана) или лейкоцитарных (сперма жеребца и хряка) меланжерах. Зарядка счетной камеры разбавленной спермой после сброса первых четырех капель, не имеющих спермиев, производится осторожным нанесением последующей капли под покровное стекло. Капля должна равномерно заполнить полость над сеткой и не иметь пузырьков воздуха. Спермии в камере располагаются в один ряд, что облегчает их подсчет. Можно разбавлять сперму в колбочках и пенициллиновых флаконах. В зависимости от нужной степени разбавления (в 20, 30, 40 и т. д. раз) в них вливают 1,9; 2,9; 3,9 и т. д. мл 3%-ного раствора поваренной соли. Затем вносят микропипеткой 0,1 мл спермы, смывают ее раствором и перемешивают во флаконе. Этот способ разбавления ускоряет исследование спермы. Подсчет проводят в 80 малых квадратах, при этом считают спермии, головки которых находятся внутри квадрата, на левой и верхней линиях квадрата. Зная объем малого квадрата, степень разбавления, вычисляют количество спермиев в 1 мл. При разбавлении спермы в 20 раз количество подсчитанных спермиев в 80 малых квадратах соответствует количеству спермиев в миллионах в 1 мл неразбавленной спермы. При разбавлении в 30 раз число нужно помножить на 1,5, в 40 раз на 2, в 100 раз на 5 и т. д. Например: подсчитано 100 спермиев. Разбавление в 20 раз — это значит 100 млн./мл спермиев, разбавление в 100 раз —500 млн./мл. Метод прямого подсчета спермиев в счетном камере является наиболее объективным и точным, он служит основным и контрольным для других методов оценки концентрации спермиев в сперме. Однако он занимает даже у опытных лаборантов по 10—15 мин времени и при необходимости определять сперму от большого количества производителей задерживает технологию обработки