Иммуноэлектрофорез ¸дiсi

Иммуноэлектрофорез ¸дiсi ¼те сезiмтал ж¸не спецификалылы¹ы жо¹ары, б½л ¸дiспен т¼мен концентрацияда ж¸не к¼п компоненттiк ж¾йелерде антиген заттарды белгiлеуге болады.

Иммуноэлектрофорез екi ¸дiстi» ºосылуында негiзделген – электрофорез ж¸не гельдегi преципитация. °дiстi» ºойылуы 2 сатыдан т½рады.

1. Зерттеуге арнал¹ан затты (антигендi) оларды» электрофоретикалыº жылдамдыº белсендiгi бойынша электрофорез к¼мегiмен гельде оны» компоненттерiне б¼ледi. Б½л ¾шiн ертiлген гельдi шынылы пластина¹а º½яды, ол ºатып ºал¹ан со» оны» ортасында ш½нºыр жасайды. Зерттеуге арнал¹ан затты ш½нºыр¹а енгiзiп, пластинканы электрофорез аппаратына ºояды. Зерттеу затты» компоненттерi ¸р т¾рлi зоналарда тасымалдайды, оларды белгiлi бояулармен аныºтайды.

2. Электрофорезден кейiн гельге иммундыº сарысуын º½йып преципитация реакциясын ж¾ргiзедi. Б½л ¾шiн компоненттердi» миграция жолдары бойынша гельде ш½нºыр жасап, иммундыº сарысуын ш½нºырлар¹а енгiзедi. Антиденелер ж¸не электрофорезбен б¼лiнген антигендiк компоненттерi бiр бiрiне ºарсы гельде диффузияланады, кездеседi ж¸не ертiндiлi емес преципитат пайдалынады. Преципитаттар ¸р т¾рлi сызыºтар болып, ¸р жерде орналасады. Осымен бiрге ¸рi антиген гомологиялыº антиденемен жеке байланысады да жеке сызыº тудырады.

Сонымен, электрофорез ¸дiсi зерттеу материалды» антигендiк компоненттерiнi» санын белгiлейдi, электрофоретикалыº ºоз¹ал¹ышы бойынша идентификацияланады ж¸не спецификалы сарысумен преципитация сызыºтарыны» мiнездемесi бойынша.

Иммунды ферменттi анализ, ИФА

Зерттелетiн материалды» º½рамында¹ы микробты» антигенi» немесе сарысуында¹ы антиденелердi аныºтау¹а м¾мкiндiк беретiн – б½л ºатты фазалыº иммунды ферменттi анализ (ºатты фазалыº иммунды сорбенттi анализ).

Тапсырма 3.

Микробтарды» антигендерiн ИФА бойынша аныºтау

Ингредиенттерi: полистиролды планшеттердi» ойыºтарына бекiтiлген белгiлi антиденелер; º½рамында микробты» антигенi бар зерттелетiн материал; зерттелетiн микробты» антигенiне пероксидазамен (Пх) белгiленген спецификалыº антиденелер; ортофенилендиамин (Оф, б½л т¾ссiз с¾йыº хромоген, бiраº пероксидазамен байланысса ºоныр т¾сi пайда болады).

Полистиролды пробиркаларды» ºабыр¹асына белгiлi антигенге ºарсы антиденелердi (антидене ºарсы антигендi) жабыстырады, зерттеуге арнал¹ан затты енгiзедi, 30-40 мин 37С инкубацияланады. Детергент ºосыл¹ан арнайы буферлы ертiндiмен ойыºтар шайылады.

Техникасы, кезе»дерi: 1. Белгiлi антиденелер бекiтiлген полистиролды планшеттiн ойыºтарына микробты» антигенi бар зерттелетiн материал енгiзiледi. 30-40 мин. 37С инкубацияланады. Детергент ºосыл¹ан арнайы буферлы ертiндiмен ойыºтар шайылады.

2.Пероксидазамен белгiленген антиденелер ойыºтар¹а енгiзiледi. 30-40 мин 37С инкубацияланады. Детергент ºосыл¹ан арнайы буферлы ертiндiмен ойыºтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин ºосыл¹аннан кейiн планшеттер б¼лменi» ºаран¹ы орында 20 мин. ½сталады.

4. ²атты фазалы ИФА н¸тижесi спектрофотометр Мультискан арºылы есептеледi.

Н¸тижелерi: зерттелетiн материалды» º½рамында микробты» антигендерi бол¹анда олар ойыºтарды» т¾бiндегi антиденелермен байланысады. Пх белгiленген антигендерiмен байланысады. Аt + Аg – Пх комплексi т¾зiледi. Аºыр¹ы кезе»де ойыºтар¹а енгiзiлген Оф Пх–мен байланысып ºоныр т¾стi болады. Б½л н¸тижелi реакция.

Егер зерттелетiн материалда микробты» антигендерi болмаса, онда буфермен шай¹аннан кейiн ойыºтарды» т¾бiнде тек ¹ана белгiлi антиденелер орналасады. Содан кейiн енгiзген Пх–мен белгiленген антиденелде ойыºтардан буфермен шайылып кетедi. Реакцияны» ая¹ында Оф т¾ссiз боп ºалады. Б½л н¸тижесiз реакция.

б) Спецификалыº антиденелердi аныºтау

Ингредиенттер: полистиролды планшеттердi» ойыºтарына бекiтiлген белгiлi микробты антигендер; зерттелетiн сарысу; пероксидазамен бекiтiлген белгiлi микробты глобулинге ºарсы сарысу; ортофенилендиамин.

ИФА ºою техникасы, кезе»дерi: 1. Белгiлi микробты» антигендерi бекiтiлген полистиролды планшеттiн ойыºтарына зерттелетiн сарысу енгiзiледi. 30-40 мин. 37С инкубацияланады. Детергент ºосыл¹ан арнайы буферлы ертiндiмен ойыºтар шайылады.

2. Пероксидазамен белгiленген АГС ойыºтар¹а енгiзiледi. 37С 30-40 мин. инкубацияланады. Детергент ºосыл¹ан арнайы буферлы ертiндiмен ойыºтар шайылады.

3. Ортофенилендиамин ºосыл¹аннан кейiн планшеттер б¼лменi» ºаран¹ы орында 20 мин. ½сталады.

4. ²атты фазалы ИФА н¸тижесi спектрофотометр Мультискан арºылы есептеледi.

Н¸тижелерi: зерттелетiн сарысудын º½рамында антиденелер бол¹анда ойыºтарды» т¾бiндегi антигендермен байланысады ж¸не буферлы ертiндiмен шайылып кетпейдi. Содан кейiн енгiзiлген АГС – Пх ойыºтарды» т¾бiнде ºалады. Аg + Аt + АГС – Пх комплексi т¾зiледi. Енгiзiлген Оф Пх–мен байланысып ºоныр т¾стi болады. Б½л н¸тижелi реакция.

Егер зерттелетiн сарысуды» º½рамында антиденелер болмаса, онда ойыºтарды» т¾бiнде тек ¹ана алдын ала бекiтiлген микробты» антигенi ºалады. Содан кейiн енгiзiлген АГС – Пх буферлы ертiндiмен шайылып кетедi, ал Оф т¾ссiз боп ºалады. Б½л н¸тижесiз реакция.