Иммуноферменттік анализдің негізі мен түрлері.
ИФА (Иммуноферменттік анализ) – ерекше антидененің қоздырушының антигеніне өзара әрекетінің реакциясы. ИФА медицинада инфекциялық аурулар, аутоимундық аурулар, ішкіутробты инфекциялар диагностикасы үшін кеңінен қолданылады. Басқа әдістермен салыстырғанда ИФА-ның басымдылығы жоғары ерекшелігінде, сезімталдылығында, реакцияны жүргізу қарапайымдылығында, түрлі сыныпты иммуноглабулиндерге антиденелерді анықтауында, антидененің титрын белгілеуінде болып табылады. Иммуноферменттік әдіс антиденелердің белгілі бір антигенге ұқсастығына негізделінеді,
Иммунноферменттік әдісте біріктірілген
иммунохимиялық анализдің ерекшелігі,
ферменттің жоғары сезімталдығы.
ELІSA әдісті пайдаланады:
аурулардың диагностикасын жүргізгенде,
сұйықтарда әр түрлі заттарды анықтағанда.
Иммунноферменттік әдіс-ELІSA әдіс келесі сатылардан құрылады. А. Зерттейтін үлгіні қатты төсенішпен байланыстырады.Б. Қатты төсенішпен байланысқан затқа қарсы алынған ерекше антиденені (Ант1) қосады, плашкаларды жуып байланыспаған Ант1 кетіреді. В. Екінші антиденені (Ант2) қосады, *Ант2 бірінші антиденемен байланысады, ал нысана-молекуламен әрекеттеспейді. Ант2 молекуласымен ферментті байланыстырады (сілті фосфатаза, пероксидаза ). Фермент боялмаған субстраттың боялған өнімге айналуын катализдейді. *Лункаларды жуып Ант1мен байланыспаған Ант2-фермент коньюгатын кетіреді.Г. Боялмаған субстратты қосады.Д. Боялған өнімнің сапалық немесе сандық мөлшерін анықтайды.
Тікелей әдіс: Антиденелерді қатты ұстаушқа енгізеді, ферменті антигенмен байланыстырады.
Артықшылығы:*әдістің кезеңдері шамалы,*әдісті автоматандыру мүмкін.
Кемшілігі: *күрделі әдіс,*ферментті коньюгаттардыі синтездеу әдісі әмбебаптықсыздығы*ферменттің активтігіне ұлгінің компонентері әсер ету мүмкін. Тікелей емес әдіс: Антигенді қатты ұстаушқа енгізеді, ферментпен иммуноглобулиндерге қарсы алынған антиденелерді байланыстырады.Иммуноглобулиндер антигенге қарсы бағытталған.Тәсілдің артықшылығы:
*ферменттің каталитикалық қасиеттеріне әсер ететін эффектерін жою мүмкіндігі бар.
35. Иммунофлюоресцентный, люминесцентный, липосомальный иммуноферменттік анализдің
Флюоресцентті иммуноанализ. АГ және АТ анықтауда альтернативті әдіс ультафиолет сәуледе жарық беретін флуоресцентті белгі қолдану арқылы жүргізіледі. Көбіне флуоресцеин, родамин, европий маркер ретінде қолданылады. Жарық беретін антиген-антидене комплексі флюроцентті микроскопта анық көрінеді.Флуоресцентті иммуно анализ иммуноферментті анализдің тікелей аналогы. Яғни, анализдің орындалу барысы бірдей. Аз концентрациялы жағдайда да жоғары дәлділік көрсетеді.
Липосомальды иммуноанализ.Липосома –бұл екі қабатты мембраналардан тұратын жасанды фосфолипид везикулалар. Антиген ішінде ферментпені бар липосомаменконъюгирленген. Антиденені қосу кезінде антиген-антидене комплексі құрылып, липосоманы лизиске ұшыратады және ішіндегі ферменттер босап шығады. Лизиске ұшыраған липосомалар санын анықтаймыз. Липосоманын ішіне белгілеу үшін: ферменттер, радиоактивті белгілер, флуоресцентті зондтар, иондар және глюкоза қолданылады. Зерттеуді сәтті жүргізу үшін липосоманың көлемі үлкен болғаны жөн.
39. иммунобиосенсорный анализ: негізгі принциптері, РИА және ИФА әдістерден айырмашылығы.Иммунобиосенсорлы анализдың жұмыс істеу принципі: биологиялық танитын элемент (инсулин молекулалары,немесе коньюгат НФ жоғары молекулярлы белок тасымалдаушымен бірге)сенсорлі чиптің (алтынмен шаңдатылған айнек пластинка)үстінде иммобилизденеді. Басқа байланысқан агент- үлгінің ерітіндісі(біріншісінде – пациенттің қан сары суын алып,оның ішінде инсулинге қатысты құрамында аутоантиденелері бар,екіншісінде – сулы үлгілер,құрамында НФ қосылыстары бар)сенсорлы чиптың устіне жағып,соның нәтижесінде иммобилизденген молекулалармен әсерлеседі(взаимодействие).Сенсорлы чиптің үстіндегі байланысу резонанстың бұрыштың өзгеруіне алып келеді.Рефракторлы индекстің өзгеру уақыты сенсорлы түрде белгіленеді.Сенсограммалар тек қана компоненттердің байланысуы жайлы ақпарат ғана бере қоймай,кинетика мен әсерлесу күші туралы ақпаратты сақтайды,ол зерттеліп отырқан қосылыстың концентрациясын анықтауға мүмкіндік береді. Әдістің артықшылығы мен аналитикалық мінездемесі:
-Жоғары деңгейлі сезімталдылық 5Е/см3;
-Концентрацияны анықтауда кең спектрлі диапозон ;(0-100Е/см3).
-экспресстілік- анализ уақыты 10 мин(ал ИФА және РИА әдістерінде ол4-24 сағатқа дейін созылады).
-Биосенсорлы чиптың қайталап қолдану мүмкіншілігі.
РИА мен ИФА әдістердің негізгі айырмашылығы
*антидене немесе антиген радионуклидбен ферменттің орына
таңбаланады.
Таңба ретінде 125I пайдаланады.
РИА артықшылығы:
*жоғары сезімталдығы,
*жоғары ерекшелігі, иммунологиялық (антиген-антидене) реакцияға
негізделінеді,
*жоғары нақтылығы;
*анализдің қарайымдылығы (простота выполнения анализа )
*жоғары жылдамдығы,
РИА кемшілігі:
*радиотаңбаның өмір сүретін уақыты шектелінген,
сондықтан реактивтерді үнемі өзгерту керек болады
*радиоактивтігін тіркеу үшін қымбат ерекше құралдар қажет;
*анализдің саңы көп болғанда айналадағы орта радиоактивті заттармен
ластану мүмкін, сондықтан сақтану керек.
ИФА. Тікелей әдіс: Антиденелерді қатты ұстаушқа енгізеді, ферменті
антигенмен байланыстырады.
Артықшылығы:
*әдістің кезеңдері шамалы,
*әдісті автоматандыру мүмкін.
Кемшілігі:
*күрделі әдіс,
*ферментті коньюгаттардыі синтездеу әдісі әмбебаптықсыздығы
*ферменттің активтігіне ұлгінің компонентері әсер ету мүмкін.
Тікелей емес әдіс: Антигенді қатты ұстаушқа енгізеді, ферментпен иммуноглобулиндерге қарсы алынған антиденелерді байланыстырады.Иммуноглобулиндер антигенге қарсы бағытталған.
Тәсілдің артықшылығы:
*ферменттің каталитикалық қасиеттеріне әсер ететін эффектерін жою мүмкіндігі бар.