2.Обнаружение кофермента над в слюне и дрожжах.

Цель занятия: изучить коферменты ферментов слюны. Качественными реакциями обнаружить НАД-зависимые дегидрогеназы в слюне и дрожжах.

Теория вопроса. Многие ферменты для проведения каталитической активности нуждаются в присутствии определенных веществ непептидной природы - кофакторов. В качестве кофакторов выступают ионы металлов, производные витаминов В₁, В₂, В₆, РР и нуклеотиды.

Фермент, содержащий кофермент, называют холоферментом, а белковую часть такого фермента - апоферментом. Взаимодействие кофермента с апоферментом отличается высокой специфичностью.

В реакциях, катализируемых НАД-зависимыми дегидрогеназами, в качестве кофермента участвует никотинамидадениндинуклеотид (НАД).

НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, много его в дрожжах и меньше в слюне. Окисленные и восстановленные формы НАД обладают разными спектрами поглощения в УФ области, что и используют для качественного и количественного определения НАД. Этот кофермент легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флюоресцирующего комплекса с ацетоном. Значительно меньше его содержание в слюне.

Ход работы:

1. К 1 мл слюны добавляют 5 капель ацетона и 2 капли 30% NaOH. Через 5 минут добавляют 1 каплю фенолфталеина и по каплям добавляют концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку встряхивают и на 2 минуты помещают в кипящую водяную баню, затем охлаждают и наблюдают слабую синюю флюоресценцию.

2. В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4-5 г, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20-30 сек, не допуская выбрасывания жидкости, отфильтровывают в пустую пробирку 5-10 капель полученного экстракта, добавляют туда 3-5 капель ацетона и 1-2 капли 30% раствора гидроксида натрия. Оставляют пробирку стоять 2 минуты, затем добавляют 1 каплю раствора фенолфталеина и по каплям добавляют концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Помещают пробирку на 2 минуты в кипящую водяную баню, после чего вынимают, охлаждают и наблюдают синюю флюоресценцию.

Контрольные вопросы:

1. Слюна проточная, смешанная. Формирование слюнного секрета.

2. Защитные системы полости рта. Иммуноглобулины слюны. Строение IgA, функция.

3. Биологическое значение определения НАД-зависимых дегидрогеназ.

Тесты: 4, 34, 60,62, 76, 87.

Литература: 4,6, 10, 33, 34

III. Тема: Ферменты слюны.

1. Качественное обнаружение активности пероксидазы и каталазы в слюне.

Цель занятия: ознакомить студентов с основными принципами обнаружения активности ферментов. Качественными реакциями установить наличие пероксидазы и каталазы в слюне.

Теория вопроса. Каталаза (КФ 1.1.11.6) и пероксидаза (КФ1.1.11.7) отно­сятся к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Ферменты каталаза и пероксидаза являют­ся антиоксидантами, так как обеспечивают прямое обезвреживание кислорода. Ферменты каталаза и пероксидаза принимают участие во всех биохимических процессах, поддерживая нормальный уровень обмена перекиси водорода, которая из-за своей токсичности не должна накапливаться в клетках. Каталаза и пероксидаза избирательно катализируют разрушение перекиси водорода, восстанавливая ее до двух молекул воды. К пероксидазам относятся ферменты, катализирующие окисление субстрата с помощью перекиси водорода.

_{пероксидаза}

Н₂О₂+АН₂ 2Н₂О+А

Слюнная пероксидаза (СПО) катализирует окисление тиоционатов путем расщепления перекиси водорода с образованием гипотиоционатов, которые оказывают антимикробное действие. Образовавшийся гипотиоционат оказывает в 10 раз более мощное антибактериальное действие, чем Н₂О₂. При спонтанном распаде Н₂О₂ образует реакционные формы кислорода: гидроксидный радикал супероксидный анионрадикал. Эти реакционные формы кислорода и гипотиоционат совместно воздействуют на ненасыщенные жирные кислоты, белки, нуклеиновые кислоты, что приводит к образованию продуктов свободно-радикального окисления, нарушению структур клеток и их гибели.

Таким образом, биологическая роль СПО в полости рта заключает-

ся в том, что с одной стороны продукты окисления тиоционатов ингибируют рост и метаболизм лактобацилл и некоторых других микроорганизмов, а с другой стороны предотвращают аккумуляцию Н₂О₂ многими видами стрептококков полости рта.

Под влиянием пероксидазы могут окисляться фенолы, полифенолы, в том числе бензидин. От субстратов под действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода. Образуются окисленный субстрат и вода. Пероксидазы относятся к геминовым ферментам: в состав их простетической группы входит гем. Пероксидаза содержится почти во всех растительных и животных клетках. В организме человека и животных гемоглобин, миоглобин и цитохромы обладают слабой пероксидазной активностью. Об этой активности можно судить по изменению окраски бензидина. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, постепенно переходящую в бурую.

Ход работы: В одну пробирку наливают 5 капель 1% раствора бензидина, 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода, затем добавляют 5 капель слюны. Наблюдают изменение окраски. Окисленный бензидин приобретает зеленую окраску, переходящую в бурую.

Определение активности каталазы в слюне.

Теория вопроса. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. По химической природе каталаза является геминоферментом, так как в состав простетической группы этого фермента входит гем.

2 Н₂О₂ ^{каталаза} 2О₂ + 2Н₂О

Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях, но особенно много ее в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Перекись водорода может образовываться в организме во время течения окислительно-восстановительных процессов.

Определение активности каталазы и пероксидазы имеет важное значение для диагностики заболеваний. Снижение активности этих ферментов в крови и слюне наблюдается у больных, страдающих вирусным гепатитом, злокачественными новообразованиями, анемией, туберкулезом.

Ход работы: В пробирку наливают 10-15 капель 1%-ного раствора перекиси водорода и добавляют 1мл слюны. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение молекул кислорода.

Оформление занятия: записать в тетрадь результаты качественных реакций.

Контрольные вопросы:

1. Ферменты слюны и их биологическая функция.

2. К какому классу относятся ферменты пероксидаза и каталаза?

3. Какой тип реакции катализирует пероксидаза?

4. Какой тип реакции катализирует каталаза?

5. Клинико-диагностическое значение определения каталазы и пероксидазы в слюне.

Тесты: 3,11,33, 58, 61,99, 100.

Литература: 5,22,23, 27, 31, 34