Биосинтез 3,4-диоксифенилаланина (дофа) (Лекция 7)

Другой (количественно преобладающий) путь трансформации тирозина – гидроксилирование под действием тирозингидроксилазы, зависящей от восстановленного птерина. В результате образуется 3,4-диоксифенилаланин, более известный под названием ДОФА. Это соединение получило широкую известность благодаря его терапевтическому эффекту при лечении болезни Паркинсона. Сильное ослабление организма, сопутствующее этой болезни, рассматривается как результат отсутствия продукта декарбоксилирования ДОФА, дофамина, в некоторых участках мозга. Введение ДОФА в пищевой рацион приводит к более эффективному образованию дофамина в ткани мозга. Суточная доза при лечении составляет 3-5 г ДОФА.

Методы получения ДОФА можно разделить на четыре основные группы: 1) экстрактивные методы; 2) химический синтез с последующим разделением рацематов и рацемизацией D-изомера; 3) ферментация микроорганизмов; 4) ферментативные методы синтеза.

ЭКСТРАКТИВНЫЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТИРОЗИНА И L-ДОФА

Одним из простых методов получения аминокислот является выделение их из гидролизатов белков растений или другого природного сырья. До настоящего времени тирозин получают именно экстрактивным методом. Источником для выделения тирозина являются некоторые растительные белки, например зеин из семян кукурузы, содержащей до 5% тирозина, и ряд белков животного происхождения: казеин и особенно шелк (фиброин). Эти белки подвергают кислотному, щелочному или ферментативному гидролизу с помощью трипсина. Выход тирозина после экстракции из вышеперечисленных белков и очистки невысок и составляет 2-10%.

Наиболее ценным сырьем для получения тирозина с высоким содержанием белка (до 90%) являются кератиновые отходы мясной, рыбной и легкой промышленности: рог, копыта, щетина, шерсть, перья, когти и т.п. По сравнению со щелочным и ферментативным расщеплением белков более рациональным является кислотный гидролиз. Полное расщепление белков протекает за короткое время, рацемизация аминокислот отсутствует. Единственным недостатком кислотного гидролиза является разрушение триптофана. Выделение аминокислот из гидролизатов осуществляют после полной их очистки от гуминовых и минеральных веществ. Выход аминокислот достигает 60-65% от их содержания в сырье, чистота составляет не менее 99%. Методы последовательного выделения тирозина, фенилаланина, цистита и других аминокислот из одного гидролизата разработаны и апробированы в полупромышленных условиях.

3,4-Диоксифенил-L-аланин найден в некоторых растениях из семейства бобовых, в наружном слое раковин некоторых моллюсков. L-ДОФА экстрагируют из растений раствором кислоты (муравьиной, уксусной, хлоруксусной или пропионовой) при рН 2-6 и температуре 10-80 °С после чего к экстракту добавляют раствора ацетата свинца для осаждения ДОФА. Экстракцией земляных бобов Vicia faba метанолом получают 18,7 г L-ДОФА из 1 кг бобов. Фирмой «Оу Medica AB» (Финляндия) предложен метод, заключающийся в адсорбции L-ДОФА из экстракта конских бобов на активированном угле с последующей адсорбцией на ионообменной смоле. Этой же фирмой используется способ экстракции L-ДОФА водой с добавлением сернистой кислоты.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СИНТЕЗА

Синтетические методы получения L-тирозина и L-ДОФА разнообразны как по способу проведения реакции, так и по исходному сырью. Количество разработанных химических синтезов 3,4-диоксифенил-L-аланина довольно велико, однако почти все они освоены лишь в лабораторных условиях. Большинство разработанных методов являются многостадийными, включающими синтез и выделение чистых и промежуточных продуктов. Исходные вещества, как правило, малодоступны и дороги, а выход D,L-ДОФА не превышает 30-45%, после разделения изомеров выход L-ДОФА – 15-20% в пересчете на исходные вещества. При получении L-ДОФА из L-тирозина выход составляет 30-40%.

Недостатком синтетических методов получения аминокислот является и необходимость разделения рацематов и рацемизация D-изомера. Среди физико-химических методов разделения рацематов аминокислот в настоящее время широко используются избирательная кристаллизация и стереоселективная хроматография. Кроме того существуют другие методы разделения. К ним относятся ферментативные методы разделения. Хорошим катализатором для разделения рацематов ароматических аминокислот является α-химотрипсин, обладающий высокой стереоспецифичностью. Использование метода в промышленном масштабе тормозится высокой ценой препарата, поскольку он выделяется из ценного животного сырья, а среди известных микробных протеаз не найден.

Одним из лучших методов разделения D,L-ДОФА является фракционная кристаллизация из раствора разбавленной соляной кислоты с помощью оптически активных агентов, например иммобилизованной ацилазы.

Рацемизацию аминокислот осуществляют при нагревании в присутствии кислоты или основания. Большинство аминокислот подвергается рацемизации при действии избытка уксусного ангидрида в уксусной кислоте при комнатной температуре. Представляют интерес методы рацемизации D-аминокислот под действием рацемаз микробного происхождения, однако практического применения они не нашли.

МЕТОДЫ ФЕРМЕНТАЦИИ

Одним из перспективных путей получения L-тирозина и L-ДОФА является микробиологическое гидроксилирование фенилаланина или тирозина. Это превращение способны осуществлять грибы, бактерии, дрожжи, актиномицеты. Японскими исследователями было отобрано 6 штаммов бактерий, принадлежащих родам Vibrio tyrosinaticus и Pseudomonas melanogenum, при выращивании которых на средах с тирозином накапливается L-ДОФА, причем степень конверсии тирозина достигает 85%.

Основным источником углерода при выращивании этих бактерий являются глюкоза и крахмальные гидролизаты, которые довольно дороги. Кроме того данный метод имеет еще недостатки: периодичность процесса, невысокие выходы целевого продукта, большая продолжительность предварительного выращивания биомассы и процесса накопления аминокислоты, необходимость соблюдения стерильных условий, использование дорогих материалов для приготовления сред, высокая энергоемкость процесса и загрязнение целевого продукта метаболитами клетки.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ

Перспективным методом получения L-тирозина и 3,4-диоксифенилаланина является ферментативный синтез. В качестве источника фермента могут быть использованы как неочищенные ферменты, так и высокоочищенные препараты фермента в свободном или иммобилизованном виде.

Как оказалось, многие штаммы-продуценты тирозин-фенол-лиазы, принадлежащие к. родам Citrobacter, Proteus, Aerobacter и др., катализируют синтез L-тирозина и L-ДОФА и их производных в реакциях β-замещения из пирувата, аммиака и фенола или его производных. Тирозин-фенол-лиаза катализирует также синтез тирозина (L-ДОФА) из аммиака, пирувата и фенола (пирокатехина). Вместо пирувата субстратами могут быть щавелевоуксусная, яблочная, фумаровая, малеиновая, глиоксиловая, молочная кислоты, соли или эфиры. В случае синтеза ДОФА, чтобы предотвратить его окисление, в реакционную смесь необходимо добавлять восстановители: сульфиты, тиосульфиты, тиосульфаты, аскорбиновую кислоту, цистеин, β-меркаптоэтанол и комплексобразующие соединения. Поскольку фенол, пирокатехин, пируват ингибируют тирозин-фенол-лиазную активность катализатора, лучшие выходы L-тирозина и L-ДОФА были достигнуты при периодическом добавлении этих субстратов.

Ферментативный синтез L-ДОФА осуществляют различные клетки микроорганизмов с тирозиназной или тирозингидроксилазной активностью, при добавлении их в буфер с тирозином. При использовании в качестве биокатализатора такого синтеза отделенных и отмытых от среды клеток Aspergillus chevalieri или Aspergillus oryzae выход L-ДОФА достигал 80%, а в присутствии аскорбиновой кислоты, используемой в качестве антиокислителя, – около 100%. Реакция протекает от одного до нескольких часов в зависимости от условий без добавления кофактора.

Известные на сегодняшний день методы получения L-форм тирозина и 3,4-диоксифенилаланина указывают на большое их разнообразие. Наибольшие выходы L-тирозина и L-ДОФА достигнуты в результате ферментативного синтеза из фенола или пирокатехина, пирувата натрия и ацетата аммония. В этом случае катализатором являлись нативные клетки бактерий с высокой тирозин-фенол-лиазной активностью. Данный процесс протекает в одну стадию, в мягких условиях, с высоким выходом целевого продукта, не требует сложного аппаратурного оформления и может быть осуществлен из веществ, выпускаемых химической промышленностью. Кроме того, ферментативные реакции стереоспецифичны и приводят к образованию одного (обычно природного) энантиомера. При использовании нативных клеток микроорганизмов отпадает необходимость добавления кофактора – пиридоксальфосфата. Таким образом, в настоящее время и в будущем ферментативный синтез является одним из перспективных методов получения L-форм тирозина и ДОФА.

ПРОМЫШЛЕННЫЙ СИНТЕЗ L-ДОФА

L-ДОФА (3,4-дигидроксифенилаланин) S-конфигурации является одним из немногих лекарственных соединений, которым можно лечить болезнь Паркинсона. Фирма "Монсанто" производит его по следующей схеме:

В основе синтеза лежит конденсация Кнёвенагеля, в которой уксусный ангидрид служит основанием и дегидратирующим агентом, а также этерифицирует фенол, в результате чего получается азлактон, который гидролизуют в производное стирола. Ключевая стадия синтеза включает энантиоселективное гидрирование этиленовой связи с образованием изомера при энантиомерной селективности 95%. Ассимметрическое гидрирование осуществляется с помощью растворимого хирального катализатора.

Для получения L-ДОФА на последней стадии проводят обработку бромистоводородной кислотой.

Применение хирального катализатора в синтезе позволяет избежать образования сме­си изомеров.

В 1968 г Уильям Ноулз (лауреат Нобелевской премии по химии за 2001 год совместно с Рёдзи Ноёри и Барри Шарплессом с формулировкой «за исследования, используемые в фармацевтической промышленности – создание хиральных катализаторов окислительно-восстановительных реакций») обнаружил, что можно получать требуемый изомер, если ис­пользовать для синтеза оптически активный катализатор. Идея создать его была основана на двух работах других исследователей. Английский химик Джеффри Уилкинсон, занимавший­ся металлоорганическими соединениями "сэндвичевого" строения, за которые он вместе с Э.Фишером получил Нобелевскую премию в 1973 г, синтезировал растворимый в воде ком­плекс трифенилфосфин родий хлорид [Rh(Ph₃)₃]Cl.

Это соединение с переходным металлом не обладало оптической активностью, но ка­тализировало реакции гидрирования. Когда Хорнер и Мислоу заменили в трифенилфосфине одну фенильную группу на метальный остаток, а другую на этильный, они получили оптиче­ский изомер фосфина. После чего Ноулз предположил, что, заменив трифенилфосфиновую группу в металлокомплексе Уилкинсона на энантиомер Хорнера и Мислоу, можно получить зеркально-симметричные формы катализатора, который в реакциях гидрирования будет пре­вращать оптически неактивный реагент (субстрат) в лево- или правовращающий продукт ре­акции. Вместе с коллегами он перебрал энантиомеры фосфинов разной структуры и создал эффективный в синтезе L-ДОФА катализатор, обеспечивающий выход конечного продукта 97,5 %.

Катализатор представляет собой комплекс родия (I), встроенного в тригональную би-пирамиду с хиральным дифосфином в качестве лиганда, связывающим также атом водорода.

Для получения катализатора используют хлоридный комплекс родия с циклооктадие-ном-1,4 и дифосфин R,R-конфигурации при давлении молекулярного водорода 4 бар.

Этот синтез иллюстрирует некоторые важные принципы синтетического дизайна:

1) при отсутствии возможности формирования ароматических колец в ходе синтеза, лучше исходить из уже готового бензольного кольца;

2) ценным представляется метод синтеза аминокислот через азлактоны;

3) использование растворимого металлорганического катализатора для асимметрического гидрирования.