2. Гидролазы

Гидролитические ферменты – важнейший класс ферментов, используемых при переработке пищевого сырья. Основной продукцией ферментной промышленности являются препараты гидролаз, таких как амилазы, протеазы, пектиназы, целлюлазы. Гидролитические ферменты используются преимущественно в начальной, наиболее трудоемкой стадии переработки органического сырья, когда необходимо расщепить структурные или запасные полимеры, фрагменты которых далее подвергаются трансформации под действием ферментов других классов.

Субстраты гидролитических ферментов – полисахариды, белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие природные соединения, содержащие «ангидридные» связи. Составляют основную массу органической материи на планете. Гидролиз – необходимая стадия круговорота этих соединений в природе. поэтому гидролитические реакции, как химические, так и ферментативные, происходят в больших масштабах в естественных условиях. Они имеют первостепенное значение и в решении многих прикладных задач.

Реакция гидролиза протекает по следующему уравнению:

R R₁+H–OH RH+R₁OH

В процессе ферментативного гидролиза происходит образование фермент-субстратного комплекса, который претерпевает внутримолекулярную перегруппировку под влиянием активного центра фермента. Катализированный разрыв ангидридной связи субстрата приводит к выделению из фермент-субстратного комплекса одного из продуктов реакции. Второй продукт выделяется после перегруппировок, связанных с присоединением молекулы воды.

Класс гидролаз – третий класс в номенклатуре ферментов – включает 11 подклассов. Ферменты подкласса 3.1 расщепляют сложноэфирные связи; 3.2 – гликозидные связи; 3.3 – эфирные связи; 3.4 – пептидные связи; 3.5– связи C–N, отличные от пептидных; 3.6 – кислотноангидридные связи; 3.7 связи С–С; 3.8 – галоидалкилные связи; 3.9 – связи P–N; 3.10 связи S–N; 3.11 – связи С–Р.

Наибольшее применение в процессах промышленного биокатализа нашли гидролазы подклассов 3.1, 3.2 и 3.4.

2.1 Эстеразы (к.Ф.3.1)

Этот подкласс включает большое число ферментов (около 150), которые разделены на 7 подклассов. Ферменты подкласса 3.1 расщепляют сложноэфирные связи.

Для эстераз характерна относительная групповая субстратная специфичность, то есть способность гидролизовать сложноэфирные связи между радикалами различного типа. Эстеразы расщепляют моно-, ди-, триглицеролы и другие соединения, содержащие сложноэфирную связь. Скорость расщепления зависит от структуры субстрата.

Наиболее важными с точки зрения участия в различных биохимических процессах, имеющих место при хранении и переработки пищевого сырья, являются ферменты подкласса 3.1.1, действующие на эфиры карбоновых кислот.

Липазы (к.Ф.3.1.1.3)

Липаза или триацилглицерол-липаза широко распространена в природе и играет важную роль в процессах, протекающих при переработке и хранении пищевых продуктов. В настоящие время выделены и охарактеризованы липазы растительного происхождения (липаза клещевины, пшеницы и других злаков), животного (панкреатическая липаза, липаза молока) и микробного (бактериальные и грибные липазы).

Липазы являются универсальными ферментами, используемыми для преобразования липидов. Субстратами липаз являются глицериды и другие сложные эфиры. Липазы более других представителей класса гидролаз обладают способностью катализировать различные типы реакций. Эти типы следующие:

1 – Гидролиз эфиров

R –COO–R₁ + H₂O R–COOH +R₁–OH

2 – Синтез эфиров

R –COOH +HO–R₁ R–COO–R₁ +H₂O

3 – Трансэтерификация

3.1 Ацидолиз

R –COO–R₁+ R₂–COOH R₂–COO–R₁ +R–COOH

3.2 Алкоголиз

R –COO–R₁ + HO–R₁ R–COO–R₂ + HO–R₁

3.3 Интерэтерификация

R –COO–R₁ + R₂–COO–R₃ R–COO–R₃+ R₂–COO–R₁

3.4 Аминолиз

R –COO–R₁ + H₂N–R₂ R–CO–NH–R₂ +HO–R₁

Гидролитическое расщепление жиров липазами протекает с заметной скоростью в средах с концентрацией воды не менее 1 %. Реакция происходит в гетерогенной среде на границе раздела фаз липиды – вода, скорость её зависит от степени дисперсности субстрата.

Обычно липазы катализируют реакцию расцепления триглицеридов согласно приведенному ниже суммарному уравнении:

Липазы проявляют специфичность в отношении оптических изомеров эфиров (стериоспецифичность), позиционную, глицеридную и жирокислотную специфичность.

По позиционной специфичности липазы делят на две группы: позиционно неспецифичные, освобождающие при гидролизе триглицеридов жирные кислоты из всех трех позиций, и 1,3-специфичные.

Большинство известных липаз предпочтительно гидролизуют сложноэфирную связь при С1 и С3 глицерола.

При длительном гидролизе глицеридов 1,3-специфичные липазы способны отщепить жирные кислоты из всех положений, поскольку 2-моноглицериды и 1,2-диглицериды, как менее конформационно стабильные, самопроизвольно изомеризуются в 1-моноглицериды и 1,3-диглицериды.

Жирнокислотная специфичность липаз выражается в предпочтении к жирным кислотам определенной длины цепи. В целом липазы легко отделяют жирные кислоты средней длины.

Глицеридная специфичность выражена не у всех липаз. Фермент из Pen. cyclopium гидролизует моноглицериды и диглицериды и практически не действует на триглицериды.

Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от друга по специфичности действия, сродству к различным субстратам, растворимости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например, липаза семян клещёвины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7-5,0; панкреатическая липаза растворима, и оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной среде. Липаза пшеничных зародышей также отличается от липазы клещевины. Она растворима в воде и имеет рН оптимум при 8,0.

Микробные липазы-ферменты с молекулярной массой 30-55 кДа, оптимальная температура действия не превышает 65°С, оптимальный рН большинства исследованных липаз лежит в слабокислой и нейтральной зоне. Бактерии рода Pseudomonas продуцируют щелочные липазы и липазы с широкой зоной рН-оптимума.

Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых продуктов при хранении. Особенно это касается продуктов, содержащих повышенное количество жира, например, овсяной муки или крупы, пшена. Накопление свободных жирных кислот под действием липазы (рост кислотного числа жира) — признак ухудшения качества продукта. Свободные жирные кислоты, особенно ненасыщенные, легко подвергаются окислению под воздействием разных факторов: липоксигеназы, тепловой обработки, кислорода воздуха, солнечного света и др. Таким образом, липазы могут инициировать процесс прогоркания и ограничивать сроки хране­ния пищевых продуктов.