12. Ферментеры с подводом энергии газовой и жидкой фазы.
Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкими фазами Основными их конструкционными элементами являются перемешивающие устройства всех известных типов, а также наличие насосов и перемешивающих устройств. Это могут быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для перекачивания культуральной жидкости.Коэффициент массопереноса кислорода в таких ферментерах может в принципе иметь любые известные значения. Перечисленные типы аппаратов применяются, главным образом, в технической микробиологии. Прогресс в области получения клеточных и рекомбинантных культур выдвигает специальные требования к биореакторам. При этом на первый план выдвигаются такие показатели,как стабильность биологических агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых условий при перемешивании и др.
13.Постферментационная стадия.Способы отделения биомассы Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции, обезвреживание отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках. Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный метод – сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости. Основные проблемы, возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0.5–1.0 мкм и менее (бактериальные клетки) и необходимостью переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка, ряда аминокислот). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры – изменение рН, нагревание, добавление химических агентов
14. Дезинтеграция клетки
Дезинтеграция клетки (cell desin-tegration) [франц. des-, от лат de- — приставка, обозначающая уничтожение, удаление, отмену чего-либо, и лат. integratio — восстановление, восполнение, от integer — целый] — разрушение клеток.
Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка. (изменения структуры конечного продукта).
Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существуют.У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N –ацетилглюкозамина и остатков N – ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками. У грамотрицательных бактерии клеточная стенка тоньше и покрыты снаружи слоем липидов.Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и β – глюканов.Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из α и β глюканов, гликопротеидов и хитина.
Состав и прочность клеточной стенки зависит от условий культивирования , скорости рост клеток, фазы , на которой они собираются , условия хранения сконцентрированных клеток и от того , экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.
Химический метод разрушения клеточных стенок – обработка щелочью. Если белковый продукт не разрушаются при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гармон роста человека очень просто выделить из клеток Е. coli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически не одной жизнеспособной клетки, что автоматически решают проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.
Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганизмов – лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, β-1,2- и β-1,6- глюканазой, хитиназой – или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях.
Клетки можно разрушать физическими методами: немеханическими (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживанием-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомогенизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффективно, особенно УЗ-излучателями, генерирующимим высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генератора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преобразователя , набора рабочих камер ( аппарат на основе УЗ-диспергатора УЗДН-1, Россия ).
При большом количестве клеток используют баллистическую дызентиригацию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мельницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, полимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро перемешивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков относительно друг друга, поверхности лопастей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, числом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концентрацией клеток (аппараты фирмы «Willi A. Bachhotem», Швейцария, «Gifford Wood Co», США).
Соударения – клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Активность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно.
Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или замороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц составляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкструдерах давление достигает 2000-4000 кг/см2, в твердофазовых экструдерах – 10000-50000 кг/см2. После экструзии давление резко сбрасывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Manton Gaulin» (США), LKB (Швеция).