6. Полуколичественный анализ

Для более точной оценки количества ДНК-мишени в реакционной смеси предпринимаются специальные подходы, известные под общим названием полуколичественного ПЦР-анализа. Приставка "полу" имеет принципиальное значение из-за условной точности результатов этого анализа.

К таким подходам следует отнести использование специального приборного обеспечения в сочетании с препаратами специфической ДНК с известной концентрацией.

К приборному обеспечению, позволяющему получать полуколичественные результаты ПЦР анализа, следует отнести модели "iCycler IQ^tm" (Био-Рад, США) и "COBAS Amplicor" (Roche, США), которые позволяют следить за кинетикой накопления продуктов амплификации. Это достигается красивым решением на стыке физики и биологии. В реакционную смесь вводят гибридизационные зонды, в состав которых входят нуклеотиды, меченные особыми реактивами - флуорофором и тушителем. Флуорофоры способны излучать энергию лишь в свободном от тушителя состоянии. На стадии отжига происходит гибридизация зондов с внутренними участками ампликонов. В процессе элонгации Taq-полимераза разрушает зонды за счет своей экзонуклеазной активности. Это приводит к попаданию меченых нуклеотидов в раствор, где они начинают флуоресцировать (рис. 8). Интенсивность флуоресценции фиксируется специальным детектором и пропорциональна количеству продуктов амплификации. Если гибридизация не проходит, то зонд остается целым, а флуорофоры, входящие в его состав, не дают излучения.

При исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество копий ДНК. Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в реакционных смесях в экспериментальном и контрольных образцах позволяет полуколичественно оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК.

Более простым, но менее надежным вариантом оценки количества специфической ДНК является метод разведений. Детекцию проводят после гибридизации с ДНК-зондами, или методом электрофореза, определяя количество работающих разведений.

При всей привлекательности полуколичественного анализа следует отметить, что для его выполнения допускается использование только препаратов ДНК с высокой степенью очистки. Важно отметить, что существуют примеси, которые могут по-разному влиять на эффективность амплификации исследуемой и контрольной ДНК. При использовании упрощенных методов выделения ДНК в большинстве случаев не представляется возможным заранее предсказать количество и состав примесей в клинических образцах.

Известно, что в некоторых случаях возможны потери ДНК на стадии выделения, что может существенно исказить значение реального количества ДНК в образце.

Кроме того, точное знание количества возбудителей в конкретном клиническом образце далеко не всегда может дать полное представление об инфекционном процессе, например, из-за различной локализации и вирулентности микроорганизмов, а также состояния иммунной системы организма хозяина.

Таким образом, существующие варианты полуколичественного анализа пока еще не имеют большой практической ценности для рутинного клинического тестирования. В то же время их польза неоспорима при оценке эффективности терапии при некоторых инфекционных заболеваниях.