Молекулярні технології

До даного класу відносяться дві технології: гібридизація in situ та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).

Гібридизація in situ

Гібридизаційні технології всіх типів базуються на тому, що основи нуклеїнових кислот в одному ланцюзі ДНК і РНК комплементарні одні до одних. Використовування позначених проб нуклеїнових кислот дозволяє виявити в клітинах комплементарні нуклеїнові кислоти. Ці комплементарні кислоти можуть бути частиною нативної ДНК клітини, частиною і-РНК, яка несе інформацію з певних генів, або частиною генома вірусів. За технологією гібридизації in situ послідовність-мішень може бути визначена в інтактній клітині, тобто не потрібно попередньої екстракції цих генів з клітини, як, наприклад, при використовуванні таких методів, як фільтраційна гібридизація (західний і східний блоттинг) і полімеразна ланцюгова реакція. Також важливо те, що при даному дослідженні послідовність-мішень мікроскопічно визначається саме там, де вона локалізується в клітині, тоді як інші методи тільки визначають її наявність або відсутність.

Гібридизація in situ найбільш широко використовується у вивченні ролі вірусів при різних захворюваннях людини, за її допомогою можуть бути визначені:

• вірус папіломи людини, який викликає різні проліферативні ураження епітелію шийки матки, піхви, статевого члена і прямої кишки;

• цитомегаловірус в різних тканинах, особливо у хворих на СНІД;

• вірус Епштейна-Барра, герпеса, який має велику роль у розвитку інфекційного мононуклеозу, лімфоми Беркітта;

• JC-вірус, який є причиною прогресивної мультифокальної лейкоенцефалопатії. Це рідкісне демієлінізуюче захворювання головного мозку, пов’язане з імунодефіцитом, стало широко поширеним у хворих на СНІД.

Полімеразна ланцюгова реакція (прл)

З появою ПЛР, з’явилася можливість визначення невеликої кількості ДНК-мішеней, проте для остаточного дослідження використовуються гібридизаційні технології. Послідовність-мішень повинна бути відома та існувати у формі двохниткової ДНК.

ПЛР складається з трьох фаз:

1. денатурація подвійної спіралі ДНК при 94^оС протягом 30-90 секунд для роз’єднання ниток;

2. введення олігонуклеотидного праймера, який з’єднується з послідовністю-мішенню; праймер з’єднується з трьома кінцями обох ланцюгів ДНК. Цей процес триває 30-120 секунд при температурі 55^оС;

3. подовження праймера шляхом додавання вільних нуклеотидів. Даний процес відбувається при дії ферменту tag-полімерази (ДНК-полімераза, яка виділяється з мікроорганізму Thermus aquaticus, який живе при високій температурі, наприклад, в гарячих гейзерах) і триває біля 60-180 секунд при температурі 72^оС. Подовження праймера призводить до формування додаткових послідовностей-мішеней, які діють як шаблони для наступних циклів. При виконанні 30 циклів, теоретично, послідовність-мішень збільшується в більйон разів.

ПЛР можна застосовувати і для визначення РНК, однак заздалегідь РНК конвертують в ДНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази. Існує велика кількість модифікацій ПЛР: in situ ПЛР, гніздова ПЛР. Полімеразна ланцюгова реакція використовується для визначення:

• генетичної характеристики пухлин з кровотворної тканини;

• транслокацій в пухлинах з кровотворної тканини і пухлинах м’яких тканин;

• різних мікроорганізмів в тканинах (бактерії, віруси, найпростіші і гриби).

За допомогою ПЛР нещодавно були відкриті мікроорганізми Tropheryma whipplei і Rochalimaea henselae, які спричиняють розвиток бацилярних ангіоматозів.

СТАТИСТИЧНИЙ АНАЛІЗ. Нові можливості морфологічного дослідження відкрили методи морфометрії і її розділів – стереології і стереометрії, які вивчають просторові властивості структур і їх взаємозв’язки. Морфометрична характеристика нормальної і патологічної морфології людини завдяки застосуванню сучасної комп’ютерної техніки дозволяє використовувати весь комплекс сучасного математичного аналізу об’єктів і явищ, що сприяє підняттю вивчення морфології людини на якісно новий рівень, розвиткові теоретичної (математичної) патології.

Вивчення структурних основ хвороб здійснюють на різних рівнях: організмовому, системному, органному, тканинному, клітинному, субклітинному та молекулярному.

Організмовий рівень дозволяє виявити хворобу цілісного організму у взаємозв’язку всіх органів і систем.

Системний рівень – це вивчення змін у тій чи іншій системі органів і тканин, об’єднаних спільністю функцій (наприклад, система сполучної тканини, системи крові, системи травлення та ін.).

Органний рівень дозволяє виявляти такі зміни органів, які в одних випадках можна добре бачити неозброєним оком, а в інших випадках застосовувати мікроскопічні дослідження.

Тканинний та клітинний рівні – це рівні вивчення змін у тканинах, клітинах і міжклітинній речовині за допомогою комплексних методів дослідження.

Субклітинний рівень за допомогою електронного мікроскопа та інших методів дозволяє виявляти перші ультраструктурні зміни у клітинах і міжклітинній речовині, що є морфологічними проявами хвороби.

Молекулярний рівень дозволяє виявляти молекули ДНК і РНК при використанні комплексних методів дослідження – електронної мікроскопії, імуноцитохімії, радіоавтографії тощо.