2.2.7 Окрашивание пааг нитратом серебра

После электрофореза ПААГ помещали в водный раствор 0,011 М AgNО₃ на 10-15 минут, затем дважды промывали в дистиллированной воде и обрабатывали гель проявителем в течение 10 минут.

3.Результаты и обсуждение

Для исследования использовали 36 парафиновых блоков с материалом первичной опухоли. После выделения ДНК из блоков (раздел 2.3) была проведена ПЦР (раздел 2.2.3). Праймеры для амплификации указаны в таблице 1. Ген VHL состоит из 3 экзонов, каждый из которых анализировали отдельно. Кроме того, первый экзон (длина 553 п.н.) был гидролизован эндонуклеазой рестрикции на 2 фрагмента (194 и 222 п.н.). После проведения ПЦР и постановки электрофореза были выбраны пробы, которые предположительно содержали инсерции или делеции (отдельные полосы с аномальной подвижностью и гетеродуплексы). На втором этапе был проведен SSCP-анализ для обнаружения однонуклеотидных замен (миссенс и нонсенс-мутации), которые нельзя было выявить в предыдущем исследовании. Пробы, содержащие мутации, были подготовлены для секвенирования (рис. 5). Последующее секвенирование позволило идентифицировать мутации.

Рис. 5. Хроматограмма секвенированной нуклеотидной последовательности третьего экзона, полученная на капиллярном генетическом анализаторе ABI3100 (“Applied Biosystems”). Локализация делеции c.584_585del показана стрелкой.

4.Выводы

1. Показано высокая частота соматических мутаций в образцах светлоклеточного рака почки;

2. Охарактеризованы типы мутаций, их распределение в кодирующей части гена.

3. Эти предварительные результаты будут использованы в дальнейшей работе по характеристике молекулярно-генетических нарушений в гене VHL при раке почки.

5. Список литературы

1. Херрингтон С., Макги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Перевод с английского. – 1999. – М.: Мир, 558 с.

2. Примроуз С., Тваймен Р. Геномика. Роль в медицине. Перевод с английского. – 2008. – Бином. Лаборатория знаний С. 16-20.

3. Lipworth L, Tarone R.E. The epidemiology of renal cell carcinoma // The Journal of urology. – 2008. – Vol. 176. – P. 2353-2358.

4. Воробьев А.В. Морфологическая классификация опухолей почки. Доброкачественные новообразования // Практическая онкология. – 2005. – № 3. – C 141-147

5. Choueiri T. K., Vaziri S.A. von Hippel-Lindau Gene Status and Response to Vascular Endothelial Growth Factor Targeted Therapy for Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma// The Journal of Urology. – 2008. – Vol. 180. – P. 860-866.

6. Richards F.M. Molecular pathology of von Hippel_Lindau disease and the VHL tumour suppressor gene // expert reviews in molecular medicine. – 2001. – P. 1-25

7. Kim W.Y., Kaelin W.G. Role of VHL Gene Mutation in Human Cancer // The Journal of Clinical Oncology. – 2004. – Vol. 22. – P. 4991 - 5004

15