1. Основна частина

1.1. Використання Drosophila melanogaster як модельного об'єкта для вивчення нейродегенеративних розладів

Нейродегенерація є характерною ознакою хвороб центральної нервової системи, що виявляються в пізньому онтогенезі в різноманітних організмів – від нематод до людини. Багато досліджень на червах, плодових мушках, мишах та людях дало змогу виявити, що подібні патології мають в основі ушкодження на генетичному рівні [8,12] і часто є наслідком мутацій в генах, що беруть участь у детермінації, диференціації та функціонуванні нейронів [12].

Нейрони безхребетних пошкоджуються також через аномальні внутрішньоклітинні процеси, порушення міжклітинних взаємодій, в результаті дії екстремальних факторів і гинуть подібно до спеціалізованих нейронів людини.Таким чином, методи молекулярної генетики безхребетних можуть бути використані для перевірки гіпотез стосовно патогенезу нейродегенеративних захворювань і пошуку лікарських засобів — супресорів нейродегенерацій [9].

D. melanogaser є зручною тест-системою для вивчення даних процесів.Дрозофіла вже понад 100 років є об’єктом для фундаментальних досліджень.Після повного секвенування геномів плодової мушки і людини, було виявлено вражаючу подібність між ними. Близько 70% генів D. melanogaser є гомологами людських [13].Деякі мутації дрозофіли спричиняють тканинно-специфічну нейродегенерацію в разі старіння. Наприклад, експресія людського α-синуклеїну і tau білків у нервовій системі дрозофіли спричиняли розвиток нейродегенеративних змін, які за багатьма фенотиповими проявами нагадували хвороби Паркінсона та Альцгеймера. Молекулярні механізми цих захворювань стали зрозумілими завдяки використанню генетичних методів, що дають змогу швидко ідентифікувати і клонувати гени, які відповідають за ці відхилення. Значна фенотипова подібність у прояві різних нейродегенеративних розладів між дрозофілою та людиною свідчить, що дрозофіла – вдалий модельний об’єкт для з’ясування ключових механізмів.Крім моделювання дегенерації нервової системи шляхом експресії людських генів у геномі дрозофіли, триває пошук нових генних мутацій, що зумовлюють нейродегенерацію [8].

Першим мутантом, у якого були виявлені нейродегенеративні зміни, був мутант swiss cheesе (sws), який характеризується віковою залежністю нейродегенерацій, апоптозом і ранньою смертю. На зрізах тканини головного мозку мутантів наявні вакуолі по всій структурі мозку. Нейродегенерація прогресує з віком, що виявляється у збільшенні числа вакуоль (рис. 1.).

А

А. Б.

Рис. 1. Гістологічні зрізи мозку D. melanogaster [7]: А. – лінії дикого типу; Б. – фенотип тканин мозку у нейродегенеративного мутанта sws

Цей ген клонували та секвенували, після чого було встановлено, що він знаходиться в Х хромосомі, розміром 25 т.п.н., зараз відомо три його алелі. Продуктом гена є білок – серин-естераза, який належить до класу гідролаз і локалізований в мембрані ендоплазматичної сітки. Даний продукт складає 50% гомології білка людини (функціонує від 3-ох місяців ембріонального розвитку до 3-ох років) [18]. Ця естераза діє на органофосфорні сполуки, які здатні індукувати відтерміновану нейропатію, що характеризується набуханням та дегенерацією аксонів ЦНС та переферійної нервової системи[2]. Механізм розвитку даного синдрому досі невідомий.

До відомих Х-зчеплених мутантів зі змінами в мозку також належать drop-dead, eggroll, spongecake, parkin, vacuous, löchrig. Вони мають знижену тривалість життя порівняно з особинами дикого типу та виявляють пов’язану з віком нейропатологію[8]. Відомо, що мутанти drop-dead мають прояв дуже схожий на ХГ – це Х зчеплена рецесивна мутація. В мух носіїв мутації drop-dead у перші 1-2 дні після вильоту спостерігається нормальна поведінка: фототаксис, геотаксис, копуляція, нормальна рухливість і політ. Далі кожна особина стає менш рухлива, координація рухів порушується, мушка падає на спину, смикає ногами і помирає. Перехід від нормальної поведінки до смерті відбувається за кілька годин [9,10]. Більшість особин гинуть на четвертий день після вильоту імаго [11].

Мутація eggroll одержана та описана К.Міном та С. Бензером у 1997 році. Ця мутація D.melanogaster була індукована етилметансульфонатом, а ген eggroll картовано в Х хромосомі[14]. Проте цей ген досі не клонований, тому і функція цього гену ще до кінця не з’ясована. Мутанти eggroll через кілька днів після вильоту ставали повільними, малорухливими і потім починали відмирати. Більшість мух помирало в межах 2-х тижнів, тоді як особини дикого типу жили більше місяця. Мутація в eggroll генів спричиняє порушення збудливості моторних нейронів, ольфакторної чутливості, поведінкових реакцій – знижується здатність до навчання, у самців змінюється ритуал залицяння. В процесі старіння в нейропілі з'являлись різного роду багатошарові структури. Деякі з них знаходились всередині аксонів навколо мітохондрій.Аналогічні щільні багатошарові включення спостерігаються і у людей з захворюванням Тея-Сакса [2,3]. Більша частина подібних структур при невропатологічних хворобах пов'язана з метаболізмом ліпідів[17]. Такі мутанти як eggroll можуть бути корисними моделями для виявлення основних механізмів розвитку аномалій накопичення.

Мутація spongecake одержана та описана К.Міном та С.Бензером у 1997 році [4]. Х–зчеплена нейродегенеративна мутація D.melanogaster. Мозок мутантів виглядав нормальним у молодшому віці, однак з віком утворюються порожнини в оптичній долі: спочатку в медулі, потім також і в ламіні та лобулі, центральна частина відносно збережена [15]. Було доведено, що при даній мутації гліальні клітини не зазнавали змін. Тіла нейронів також були нормальними. Однак, аксони в оптичній долі мали пошкодження, з чого зробили висновок, що порожнини утворювалися внаслідок руйнування аксонів. Тривалість життя мутантів не більше 2-х тижнів.Зміни в тканині мозку spongecake вражаюче подібні на мембранно-зв’язані порожнини, які видно у закінченях аксонів при хворобі Кройцфельда-Якоба – пріоновій хворобі людини, що характеризується губчастоподібною енцефалопатією [14].

У дрозофіли було виявлено ген, який є ортологом гена Parkin людини (гомологія 59%). Ген дрозофіли розташований у третій хромосомі та кодує поліпептид розміром 468 амінокислотних залишків, який гомологічний до людського на 42%. Цей поліпептид складається з чотирьох доменів. Шляхом Р–інсерційного мутагенезу, було одержано колекцію мутантів з делеціями певних частин цього гену і один був з повністю делетованим геном [11]. Фенотипово мутація проявлялась вкороченою тривалістю життя, стерильністю самців і порушенням статевої поведінки, зокрема, поведінкових реакцій залицяння. Також спостерігалась не здатність до польоту у зрілому віці через руйнування цілісності мязів, причому м’язи одно- чи дводенних особин мали зменшену щільность міофібрил та вкорочення саркомер. Фенотипові такі структурні зміни проявлялись не нормальним, пониклим положенням крил. У м’язах мутантів спостерігалось зменшення кількості мітохондрій та їх розмірів, що виступає індикатором м’язевої дисфункції[10]. Отже, втрата гена parkin зумовлює прогресуючу з віком дегенерацію м’язів.

Мутація в гені vacuous (vacu) отримана шляхом хімічного мутагенезу, як мутаген використовували алкілюючий агент етилметансульфанат.Шляхом рекомбінантного аналізу було картовано ген vacu, що знаходиться у третій хромосомі.Фенотипова мутація проявлялась личинковим паралічем при 38°С [12]. Мутантні личинки, покладені на гарячий агарний блок, одразу припиняли повзання, тоді як личинки дикого типу, енергійно продовжували рух при цій температурі. Не дивлячись на те, що дорослі особини vacu характеризувались порушеннями у поведінці, які стають більш чіткими при старінні, молодші особини не демонстрували очевидного термочутливого паралічу. Додаткові дослідження поведінки мутантів показали зниження рухової активності та зменшену здатність до польоту. Крім того була зафіксована менша життєздатність мутантів vacu у два рази в порівнянні з диким типом. Аналіз головного мозку особин vacu показав прогресуючу картину нейродегенерації у центральній і оптичній частині, де починалось руйнування нервової тканини. Нейродегенерація у мутантних особин не обмежувалась головним мозком, а також з високою пенетрантністю спостерігалась у сагітальній частині грудного ганглія. У м’язовій тканині старих vacu дегенерація не спостерігається[12].

Мутація löchrig отримана шляхом Р-інсерційного мутагенезу, ген знаходиться в 3-й хромосомі і складається з 72 т.п.н., зараз одержано декілька алельних форм. Продуктом гена є протеїнкіназа. Патологічними проявами цієї мутації є дегенерація нейронів і порушення гомеостазу холестеролу, який виконує важливу функцію в структурі мембран і є попередником бета-амілоїду, який накопичується в головному мозку при ХА [13].

Подібні дослідження на D. melanogaster достатньо інформативні, вони доводять, що плодова мушка – це хороша система для моделювання нейродегенеративних розладів людини[8].