5.2. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

1. Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды, персонала, вентиляционной системы — в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами.

2. Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания) включает:

- качественный подбор необходимых для данной культуры веществ;

- оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;

- нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред.

3. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при температуре 37 °С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой рубашкой.

4. Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.

5. Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 75°. Содержимое ампул замораживают при температуре -40 °С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации.

6. Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы укупоривают) с газовой защитой.

7. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук.

8. Контроль качества готовой лекарственной формы.

5.3. Частная технология препаратов нормофлоры

Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Lactobacillococcus. Лактобактерий представляют собой грамположительные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере СО₂, N₂, О₂.

Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов.

1. Приготовление и стерилизация питательных сред:

1.1. Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обезжиренному молоку с рН 7,7±0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 °С 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутыли и стерилизуют).

1.2. Приготовление дрожжевого аутолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют).

1.3. Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой аутолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы и др.).

1.4. Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хлороформ, выдерживают пять суток при 45 °С, затем фильтруют в бутыли и стерилизуют).

1.5. Приготовление казеиново-дрожжевой среды.

1.6. Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза, молоко, натрий лимоннокислый и вода).

2. Получение маточной культуры

Готовят 6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях - в течение 9 суток.

3. Выращивание производственной культуры

Выращивание осуществляют в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 37 °С (в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд. живых микробных клеток), затем к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания - сахарозно-желатозную или обрат молока.

4. Розлив лактобактерина в ампулы

Доза бактериального препарата зависит от концентрации живых микробных клеток в производственной культуре.

5. Лиофильная (сублимационная) сушка:

5.1. Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклонно под углом 75°, в течение 18-24 ч в холодильной камере до минус 40 °С.

5.2. Лиофилизация (сублимирование) - сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации 68-70 ч.

6. Запайка ампул

Запайка осуществляется в режиме газовой защиты - в атмосфере азота.

7. Контроль качества:

7.1. Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кисломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически.

7.2. Подлинность определяется наличием характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств в производственных штаммах лактобацилл.

7.3. Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5±0,5.

7.4. Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5%, в таблетках 5%.

7.5. Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очищенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 мин образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Определяют визуально.

7.6 Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически.

Бактериоскопически - путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Грамму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположительные).

Бактериологически - путем посева на питательные среды и инкубации в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнаружен рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производится повторный посев удвоенного количества образцов. В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (допускается наличие микробов сапрофитов в количестве не более 300 на 1 таблетку).

7.7. Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной дозы. Наблюдение за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повторяют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание, в противном случае данную серию препарата бракуют.

7.8. Специфическая активность. Определяется активность по количеству жизнеспособных клеток лактобацилл в 1 дозе препарата, а также активности кислотообразования.

7.8.1. Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для определения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкубации при температуре 37 °С производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата.

7.8.2. Определение активности кислотообразования проводят тит-риметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титруют раствором натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового окрашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2·10⁹ живых лактобацилл. Показатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не менее 200.

7.9. Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата.

8. Маркировка и упаковка

При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таблетирование ведут методом прямого прессования в асептических условиях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50% при 18 °С). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С целью защиты бактерийных препаратов от агрессивной кислой среды желудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулированные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков.

Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампулах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток. Хранят препарат в сухом, темном месте при 5±3 °С. Срок годности равен 12 месяцам, если в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд. и более живых лактобацилл; 6 месяцов - при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности в бактериальном препарате должно содержаться 1 млрд. живых лактобацилл.