1.2. Метод фотоколориметрии

По сравнению с другими методами фотоколориме­трический метод является наиболее объективным и дает более точные данные. Принцип работы фотоколориметра заключается в следующем, световой поток, проходя через окрашенный раствор, поглощает­ся не полностью. Часть светового потока, прошедшего через раствор, попадает на фотоэлемент, который преобразует световую энергию в электрический ток. Возника­ющий в фотоэлементе ток регистрируется с помощью микроамперметра [10].

Фотоколориметры предназначены для измерения оптической плотности растворов в диапазоне 200-900 нм.

Оптическую плотность стандартного и анализируемого растворов всегда измеряют по отношению к раствору сравнения, или нулевому раствору. В качестве такого раствора можно использовать раствор, содержащий все добавляе­мые реактивы, кроме определяемого вещества. Если же все компоненты раствора сравнения и добавляемый реагент бесцветны и, следовательно, не поглощают оптического излучения в видимой части спектра, то в качестве раствора сравнения можно использовать дистиллированную воду.

Определение концентрации растворов на фотоколори­метрах проводят обычно с помощью градуировочного гра­фика (рис.1.2.1.).

Рис.1.2.1. Пример градуировочного графика для определения концентрации фотоколориметрическим методом [10]

Градуировочный график отражает связь между оптической плотностью А и концентрацией С. Оптическую плотность называют также абсорбцией (А). Для построения градуировочного графика готовят стандартный раствор, содержащий строго опреде­ленное количество исследуемого вещества. С этой целью точно измеренные объемы исходного стандартного раствора, содержащего определенную концентрацию исследуемого вещества, переносят в мерные кол­бы вместимостью 100 или 50 мл и добавляют соответствующие реактивы, вызывающие окраску анализируемого раство­ра. Затем содержимое каждой колбы доводят дистиллиро­ванной водой до метки. Определение оптической плотнос­ти приготовленных стандартных растворов начинают с раствора, окрашенного слабее других, соответственно этот раствор обладает меньшей концентрацией по сравнению с другими растворами. По полученным данным строят градуировочный график.

В дальнейшем по градуировочному графику определяют концентрацию вещества в анализируемом растворе, зная его оптическую плотность [10].

1.3. Метод электронного парамагнитного резонанса

Метод ЭПР является основным методом для изучения парамагнитных частиц присутствующих в биологических системах. К парамагнитным частицам имеющим важное биологическое значение относятся два главных типа соединений - это свободные радикалы и металлы переменной валентности (такие как Fe, Cu, Co, Ni, Mn) или их комплексы. Кроме свободнорадикальных состояний методом ЭПР исследуют триплетные состояния, возникающие в ходе фотобиологических процессов [11].

Орбитальное и спиновое движение электронов лежат в основе существовании у них орбитального и спинового механических моментов. Магнитный момент электрона складывается в общем случае из спинового и орбитального магнитных моментов. Однако, в большинстве случаев, орбитальный магнитный момент равен нулю. Поэтому при обсуждении принципа метода ЭПР будет рассматриваться только спиновый магнитный момент.

В отсутствие внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентированы случайным образом (рис. 1.3.1. А), и их энергия практически не отличается друг от друга (Е0). При наложении внешнего магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются в поле в зависимости от величины спинового магнитного момента (рис. 1.3.1. Б), и их энергетический уровень расщепляется на два (рис. 1.3.2.).

Рис.1.3.1. Ориентация магнитных моментов электронов А) в отсутствии внешнего магнитного поля Б)во внешнем магнитном поле Н [11]

Рис.1.3.2. расщепление энергетических уровней одиночных электронов в магнитном поле (эффект Зеемана), где H напряжение магнитного поля, g коэффициент пропорциональности [11]

Уравнение (1) описывает эффект Зеемана, который заключается в следующем: энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля.

Основное уравнение резонанса. Количество электронов, имеющих ту или иную энергию, будет определяться в соответствии с распределением Больцмана, а именно

(2)

где n1 и n2 количество электронов на более высоком или более низком энергетическом уровне, соответствующем магнитному моменту электрона со спином +1/2 или -1/2

Если теперь на систему электронов, находящуюся в магнитном поле, подать электромагнитную энергию, то при определенных значениях величины энергии падающего кванта будут происходить переходы электронов между энергетическими уровнями. Необходимым условием переходов является равенство энергии падающего кванта (hν) разности энергий между уровнями электронов с различными спинами (gβH).

Уравнение ΔE=hν=gβH выражает основное условие поглощения энергии электронами. Под влиянием излучения электроны, находящиеся на более высоком энергетическом уровне, будут испускать энергию и возвращаться на нижний уровень. Электроны же, находящиеся на нижнем уровне, будут поглощать энергию и переходить на более высокий энергетический уровень, это явление называется резонансным поглощением. Поскольку вероятности одиночных переходов между энергетическими уровнями равны, а общая вероятность переходов пропорциональна количеству электронов, находящихся на данном энергетическом уровне, то поглощение энергии будет преобладать над ее излучением.

Необходимо отметить особое положение свободных радикалов, то есть молекул, имеющих не спаренные электроны на внешней электронной орбитали, в распределении электронов по уровням энергии. Если на орбитали имеется парное количество электронов, то заселенность энергетических уровней будет одинакова и количество поглощенной энергии электронами будет равно количеству излученной энергии [12].

Площадь под линией поглощения образца пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в нем. Таким образом, концентрация парамагнитных центров пропорциональна первому интегралу под линией поглощения или второму интегралу от спектра ЭПР.

Рис.1.3.3. ЭПР-спектр, первая производная поглощения амплитуды (А) по магнитному полю (Н) [11]

Для определения концентрации измеряют площади под кривой поглощения у эталона с известной концентрацией парамагнитных центров [13] и у измеряемого образца и неизвестную концентрацию находят из пропорции, при условии, что оба образца имеют одинаковую форму и объем:

(3)