Методика

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛАСТИНКИ. Суспензию 25 г силикагеля Н в 66 мл дистиллированной воды перемешивают в стакане стеклянной палочкой в течение 5 мин (до получения однородной массы) и выливают на чистую пластинку размером 20х20 см. Держа пластинку в руках, наклоняют ее в разные стороны так, чтобы суспензия равномерно распределилась по всей поверхности. Пластинку сначала помещают на горизонтальную подставку и выдерживают 2 ч при 25 °С, а затем переносят на подставку для хранения, где она сушится примерно 12 ч на воздухе. Пластинку активируют 2 ч при 130°С и медленно охлаждают до ~25°С. После того как края слоя выровнены шпателем, можно наносить образец. Толщина слоя сорбента 2 мм.

НАНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦА. В кончик пипетки помещают тонкий ватный тампон таким образом, чтобы часть его (3—5 мм) оставалась снаружи. Раствор 0,3—0,5 г смеси аномерных метил-2,3,6-три-O-бензил-4-O-этил-D-глюкопиранозидов в 1—2 мл хлороформа засасывают в пипетку и наносят в виде полосы на пластинку на расстоянии 2 см от ее нижнего края и 3 см от боковых краев. Чтобы полоса получилась узкой (0,5 см), необходимо между нанесениями дать хлороформу испариться.

При разделении смесей рассматриваемого типа в центре пластинки, пока она еще не высохла, отчетливо видны две полосы, расположенные на расстоянии 1 см. Эти полосы, соответствующие a- и b-D-гликозидам, видны также на сухой пластинке в длинноволновом УФ-свете.

Обнаруженные зоны собирают с пластинки, используя «вакуум-очиститель». Последний представляет собой стеклянную трубку диаметром 25 мм; на одном конце трубки имеется отверстие диаметром 6 мм, через которое засасывается сорбент. Другой конец трубки присоединен к вакуум-насосу. Для улавливания сорбента в трубку помещают кусок стеклянной ваты. К попавшему в трубку сорбенту добавляют хлороформ (20 мл), осадок отфильтровывают и промывают 20 мл хлороформа. Фильтрат упаривают при пониженном давлении и остаток повторно растворяют в хлороформе, чтобы удалить все следы сорбента. Из нижней зоны выделяют в виде бесцветного сиропа метил-2,3,6-три-О-бензил-4-О-этил-a-D-глюкопиранозид.

Из верхней зоны выделяют метил-2,3,6-три-O-бензил-4-O-этил-b-D-глюкопиранозид.

5. Распределительная хроматография на ионообменных смолах

Впервые разделение углеводов методом распределительной хроматографии на ионообменных смолах в смесях растворителей различной полярности было описано в 1952 г. В последние годы метод был значительно усовершенствован. В качестве элюента при разделении сахаров и их производных наиболее пригоден водный спирт, и далее речь будет идти только об этом элюенте.

Одним из основных факторов, обусловливающих сорбцию сахаров точно так же, как и других полярных неэлектролитов в данном виде хроматографии, является неодинаковое распределение компонентов элюирующей смеси между смолой и внешним раствором. В случае водного спирта относительное количество воды в неподвижной фазе выше, чем в подвижной, и этим объясняется тот факт, что смолой преимущественно удерживаются полярные вещества. На состав подвижной и неподвижной фаз существенное влияние оказывает также взаимодействие смола - растворитель и смола - растворенное вещество. При

смене противоиона порядок элюирования некоторых сахаров может измениться.

Коэффициенты распределения веществ возрастают с увеличением концентрации спирта и уменьшаются с повышением температуры. За редким исключением, коэффициенты распределения растут с увеличением числа гидроксильных групп в молекуле. Введение в молекулу неполярных групп, например метильных, приводит к уменьшению коэффициента распределения. Величина последнего зависит также от положения заместителей.

В табл.5 приведены коэффициенты распределения ряда свободных сахаров.

Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно- и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ионогенных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров. Этот метод можно использовать как в аналитических, так и в препаративных целях.

Таблица 5. Коэффициенты объемного распределения (Dv) некоторых моносахаридов и ангидросахаров при различных температурах и концентрациях спирта

Сахара		Пористая смола (SO42-) 75°С		Смола малой Емкости (SO42-) 75 °С		Дауэкс (SO42-) 90°С	Дауэкс (Li+) 75 °С		Амберлит IR-120 (Li+)
									75 °С	100 °С
Концентрация этанола, %
	88		86		90	86	92,4		92,4
Эритроза	3,08						1,9
Треоза	3,84						1,4
Рибоза	6,55		4,06		5,80	4,98			4,0	3,1
Арабиноза	10,1		6,26		9,79	7,56			3,8	3,0
Ксилоза	12,5		7,38		12,1	9,19	2,7		3,0	2,4
Фруктоза	13,5		8,04		13,8	10,3			5,6	4,3
Сорбоза			8,93		15,6	11,0			4,6	3,7
Манноза	16,4		9,37		16,9	11,8			5,3	4,4
Галактоза	23,4		13,0		24,4	16,1	5 7		6,8	5,3
Глюкоза	28,1		14,9		29,5	19,5	4 8		5,4	4,4
Альтроза	16,6						4 2
Рамноза	4,75		2,80		4,11	3,54			1.4	1,2
Фукоза			3,25		4,96	4,19			2,4	1,8

На рис.4 приведена принципиальная схема прибора, используемого для разделения сахаров. Элюент (спирт — вода) помещают в колбу Мариотта и обезгаживают кипячением, чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха в колонке. За колбой расположена открытая градуированная трубка, обычно заполненная элюентом. Скорость движения элюента в системе регулируют, перекрывая выходное отверстие колбы. Элюент подается в колонку поршневым насосом из нержавеющей стали который помещают ниже остальных аппаратов системы элюирования..

Рис. 4 Аппаратура для проведения хроматографического разделения и автоматического анализа сахаров орциновым методом.

Давление измеряют манометром Бурдона, снабжённым прерывателем. Последний отключает насос и нагреватель, если давление в системе превышает норму (80 атм) и также если оно падает из-за утечки жидкости. Анализ можно проводить на колонках, имеющих пористое дно и тефлоновое уплотнение на верхнем конце колонки. Если работа ведется при высоком давлении, не рекомендуется пользоваться колонками со стеклянными фланцами. Вместо них можно использовать стеклянные трубки с приклеенными эпоксидной смолой муфтами из поливинилхлорида.

Чтобы в колонке поддерживалась требуемая температура(70-90 °С), по рубашке колонки циркулирует вода из термостата. Повышение температуры колонки приводит к сужению зон вымываемых веществ и снижению рабочего давления.

Смолы, применяемые в распределительной хроматографии, представляют собой сильноосновные аниониты или сильнокислые катиониты, основу которых составляет сополимер стирола и дивинилбензол. В аналитических колонках, диаметр которых равен 2—6 мм, а скорости элюирования высокие (8—20 мл-см-2мин-1), рекомендуется использовать мелкозернистые смолы с размером частиц 8—13 или 10—15 мкм. Для препаративнго разделения сахаров на широких колонках (диаметр 12—25 мм) и при меньшей скорости элюирования можно применять более грубые смолы.

Колонку промывают элюентом до тех пор, пока не образуется однородный слой ионита. После этого растворитель, находящийся над слоем смолы, отсасывают, в колонку переносят новую порцию суспензии и операцию повторяют. Перед хроматографическим разделением заполненную колонку приводят в состояние равновесия с элюентом данного состава, промывая ее элюентом не менее 16 ч.

АНАЛИЗИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. Определение сахаров и их различных производных в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов хранят в бутыли из темного стекла, откуда он и подается в систему при помощи поршневого насоса. Между насосом и тройником, в котором происходит смешение элюата с раствором красителя, расположено устройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления (рис. 4). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеевик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, погруженный в термостатируемую полигликолевую баню (100°С). Время нахождения смеси в змеевике около 10 мин. Интенсивность окраски раствора определяется спектрофотометрически при 420 нм проточных кюветах с l 2—15 мм. Удобно пользоваться системой из двух последовательно соединенных кювет разной длины: если на более длинной кювете самописец «зашкаливает», измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм удается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На колонках меньшего или большего диаметра можно проанализировать соответственно меньшее или большее количество смеси.

Достоинством вышеописанной схемы анализа является высокая точность количественного определения и отсутствие необходимости в частом построении калибровочных кривых (при постоянстве условий анализа). Если удается достичь полного разделения компонентов, отклонение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет 1енее 1%. Однако весь элюат расходуется за одно определение, и потому не удается провести дополнительное исследование фракций.

Если проводится препаративное разделение или если проводимые исследования требуют повторного разделения и дополнительных анализов компонентов смеси, то для разделения потока элюата и введения растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Такая схема анализа (рис. 5) отличается большей гибкостью, однако недостатком ее является более низкая точность количественных определений в связи с тем, что соединительные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней.

Рис. 5. Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих сахаров и альдитов.

М- сместители; Р1 и Р2 – гасители пульсации; L – флуоресцентная лампа трубки; А – орционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная кислота; В – периодат-формальгидный канал: 0,015Мметапериодат натрия, содержащий 5 мл конц. соляной кислоты на литр

На рис.5 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат делится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрасывается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров периодатным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются периодатом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D-фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода.