5.1.4. Методы идентификации l-форм бруцелл

Для определения принадлежности выделенных L-культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, а также способность к росту на специфической питательной среде с пенициллином.

Характер роста и морфологии L-форм бруцелл.

L-колонии бруцелл могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. Колонии от 2 до 3 мм имеют золотистый цвет, слизистую консистенцию, часто врастают в агар. При просмотре через бинокулярную лупу МБС-1 L-колонии имеют вид "яичницы" - плотный центр и ажурные светлые края.

Микроскопия нативных препаратов.

Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и из них готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют одну каплю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.

По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться как внутри крупных клеток, так и лежать свободными зернистыми массами. В препарате могут находиться клетки от 0,2 до 0,5 мкм гетероморфные или близкие по морфологии к нормальным клеткам бруцелл.

Проба со специфической сывороткой.

L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл. Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной антисывороткой в разведении 1:25. Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. Поэтому рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве физиологического раствора и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной сыворотки или физиологического раствора в качестве контроля.

Скорость специфической реакции агглютинации может быть только замедленной. Характер агглютината при положительной реакции обычен.

5.1.5. Методы дифференциации бруцелл

После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).

Проба с раствором трипафлавина (на стекле).

На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро через 1 - 2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Реакция термоагглютинации.

9

2 - 3 мл 1 x 10 мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в

физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане

при 90° в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1

час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной

температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно

выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия

недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации

подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO2, образование H2S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу "Тб".

Дифференциация по образованию сероводорода.

В качестве реактива применяют водный раствор уксусно-кислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1 x 8 см. Полоски затем просушивают. Заготовленные впрок сухие полоски фильтровальной бумаги хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой не более 1 - 2 месяцев.

9

Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе (2 x 10

мкл в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную

поверхность печеночного агара (pH - 6,8 - 7,2). Затем берут

полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной

пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним

краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна

быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °C.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевом конца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.

Результаты учитываются через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете темневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают.

Для В.suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12 - 20 мм, для В.abortus (биовар 1) - около 5 - 7, В.melitensis (биовар 1), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение свинцовой бумажки. У штаммов В.neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5 - 8 мм. Культуры В.ovis и В.canis сероводорода не образуют.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок.

Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды - агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин - 1:50000, тионин - 1:50000.

При отсутствии стандартных оттитрованных красок рабочие их дозы можно оттитровать с использованием эталонных штаммов бруцелл. Для этого испытуемые краски добавляют к среде в различных концентрациях. Концентрация красок в среде, с которой получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл (В.melitensis 16M, В.abortus 544, В.suis 1330), и являются рабочей дозой данной краски. Основные растворы фуксина и тионина готовят в концентрации 1:1000 (0,1 г краски, 20 мл 96° спирта и 80 мл дистиллированной воды). Флаконы с краской хранят в темном месте в течение 6 - 10 месяцев. Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45 - 50 °C агара стерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 - 25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Среды с красками должны храниться в холодильнике (+4 °C) и пригодны для работы в течение 10 - 15 дней. Обесцвеченные среды применять нельзя.

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно одновременно засевать 4 - 6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4 - 6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37 °C. Учет результатов проводят через трое суток инкубации.

Схема учета:

- интенсивный рост по всему штриху 4+;

- интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+;

- менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+;

- очень слабый рост по ходу штриха или отдельные колонии +.

Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками.

Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор, pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида В.melitensis; б) контроль с эталонным штаммом В.abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °C 18 - 20 часов, а затем в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20 , но не менее чем на 2+.

Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биоваров бруцелл, находящихся в R-форме, для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере, pH 8,2 - 8,4.

Определение чувствительности культур бруцелл к фагу.

Бруцеллезный фаг "Тб" избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод:

Питательная среда - 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25 - 30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18 - 20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.

Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из

которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета

9

1 x 10 мкл в 1 мл, 0,4 - 0,5 мл из этой взвеси наливают на

поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения

равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской

пипеткой.

Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре

37 °C. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной капле фага

2

в концентрации по 10 x 10 корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро

наклоняют и капли фага стекают по дорожке. Места нанесения капель

и путь стекания капли можно заранее расчертить карандашом на

внешней стороне дна чашки.

Учет результатов.

Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке) "4+", лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки в виде сот "3+". Резко ослабленный рост и небольшое количество бляшек "2+", очень слабый лизис "+" и отсутствие лизиса "-" - результат отрицательный.

Оценка результатов.

За положительный результат следует принимать лизис культуры минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве контроля рекомендуется включать референтные штаммы В.melitensis 16M, В.abortus 544 и В.suis 1330.

Дифференциальные свойства видов и сероваров рода Brucella: см. таблицу.X

5.1.6. Иммунологические и молекулярно-биологические тесты выявления бруцелл и их растворимые антигены

Учитывая, что бруцеллы относятся к медленно растущим микроорганизмам и окончательный ответ бактериологического и биологического методов исследования можно ожидать только через 3 - 5 недель, были разработаны тесты, основанные на иммунологическом взаимодействии специфического антигена и антител (реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - прямой метод, реакция нейтрализации антител (РНАт), иммуноферментный анализ (ИФА), а также молекулярно-биологический метод - полимеразная цепная реакция (ПЦР)). Технику постановки этих методов см. в разделе 4.X

5.2. Методы выявления специфических антител

При бруцеллезе рекомендуется несколько методов, которые используются в зависимости от целей исследования.

При проведении эпидобследования населения в очагах рекомендуется: реакция агглютинации - пластинчатая (Хеддлсона), РПГА, ИФА, кожно-аллергическая проба Бюрне.

При обследовании населения перед профилактической вакцинацией: пластинчатая реакция агглютинации (Хеддлсона) или ИФА и кожно-аллергическая проба Бюрне или реакция лизиса эритроцитов.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза проводят бактериологические исследования, ставят реакцию агглютинации и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса. Может быть использована ИФА.

Для диагностики хронического бруцеллеза и при проведении диспансерного наблюдения за переболевшими бруцеллезом рекомендуется реакция Кумбса, ИФА и аллергические тесты.

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменять друг друга. Это обуславливает необходимость применения комплексного серо-аллергического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (в первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического; серологические реакции в этот период оказываются положительными почти в 98% случаев. По мере удлинения срока заболевания процент положительных серологических реакций (реакция агглютинации, РПГА) начинает падать. В поздние периоды заболевания большую диагностическую ценность имеет реакция Кумбса, ИФА и внутрикожная аллергическая проба.

При проведении обследования нужно учитывать, что если высокие титры антител почти всегда указывают на наличие инфекции, то антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключают возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется проводить повторные исследования с интервалом 1 - 2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Следует иметь в виду, что положительную реакцию агглютинации с бруцеллезным антигеном могут давать также сыворотки, содержащие антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигенные детерминанты с бруцеллами (Е.coli, V.cholerae, Fr.tularensis, Y.enterocolitica 0 - 9, S.typhimurium).