14. Заключение

Испытуемый вакцинный штамм, удовлетворяющий настоящим Методическим указаниям по всем свойствам, может быть допущен до следующего этапа внедрения - клинических испытаний на людях. На основании результатов государственных доклинических испытаний, заключений Национального органа контроля ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитета медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) о соответствии испытуемого штамма F. tularensis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными Методическими указаниями, Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации разрешает проведение на людях клинических ограниченных, а затем государственных испытаний вакцины, приготовленной на основе испытуемого штамма. Программа испытаний согласовывается с ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Комитетом МИБП и Комитетом по этике при федеральном органе контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств.

Испытуемый штамм туляремийного микроба, удовлетворяющий всем перечисленным требованиям, прошедший с положительным заключением государственные испытания, может быть признан как вакцинный и утверждается Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Приложение 1

(обязательное)

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО

ШТАММА ПО ВИДОВЫМ ПРИЗНАКАМ

1.1. Подготовка к исследованию испытуемого и контрольного

вакцинных штаммов туляремийного микроба

Ампулы с сухой культурой испытуемого и контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба вскрывают с соблюдением правил асептики и растворяют содержимое каждой ампулы в 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Затем засевают полученной микробной взвесью ряд пробирок со скошенной питательной средой Мак-Коя <*> или FT-агаром (ФСП 42-0181-1372-01) и выращивают в течение 48 ч при температуре (37 +/- 1) °С - получают культуру 1 пассажа, которую пересевают аналогично, получая культуру 2 пассажа. Часть пробирок исходной культуры 1 пассажа запаивают и хранят при температуре (4 +/- 1) °С на случай повторения посевов и изучения свойств. Двухсуточную культуру 2 пассажа изучают по основным культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам.

-------------------------------

<*> Приготовление питательной среды Мак-Коя. Свежие куриные яйца моют щеткой с мылом в теплой воде, затем кладут в 5%-й раствор соды на 20 мин., после чего промывают теплой водой и помещают на 20 мин. в 5%-й раствор карболовой кислоты, вновь промывают водой и кладут на 20 мин. в 70° этиловый спирт. Из обработанных таким образом яиц стерильно извлекают желток, тщательно отделяя его от белка, желтки сливают в стерильный градуированный сосуд и смешивают со стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,1 +/- 0,1 в пропорции 60 частей желтка и 40 частей 0,9%-го раствора натрия хлорида. Желточную среду разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл в каждую и помещают в аппарат для свертывания и инактивации сыворотки (МРТУ 42-2473-65) при температуре 80 °С на 1 ч. Готовую среду ставят на сутки в термостат при температуре (37 +/- 1) °С для проверки ее стерильности. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость. Среду хранят при температуре 4 - 6 °С в течение одного месяца.

1.2. Определение культурально-морфологических свойств

испытуемого штамма туляремийного микроба

Культуры испытуемого и контрольного штаммов F. tularensis на

питательной среде Мак-Коя растут в виде извилистого, слегка

блестящего, почти бесцветного налета; на FT-агаре - в виде

единичных беловато-серых блестящих круглых колоний не менее 1 мм

диаметром. В мазках, окрашенных по Граму, микробы имеют вид

грамотрицательных полиморфных мелких кокков или овоидных палочек.

Для определения степени диссоциации изучаемого штамма из

двухсуточной культуры 2 пассажа готовят взвесь концентрацией 5 х

9

10 м.к./мл туляремийного микроба в 0,9%-м растворе натрия хлорида

по стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-85П),

разводят ее 0,9%-м раствором натрия хлорида в 5 раз до

9

концентрации 1 х 10 м.к./мл, затем последовательно десятикратно

3

разводят до концентрации 1 х 10 м.к./мл. Из этого разведения

делают высев культуры по 0,1 мл на 5 чашек Петри, содержащих

FT-агар, и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 2 -

5 сут. После появления колоний чашки ставят в холодильник на 1

сут. при температуре (4 +/- 1) °С, после чего подсчитывают не

менее 100 колоний на каждой чашке. Не менее 80% из подсчитанных

колоний должны быть иммуногенными (SR-типа) белого цвета.

1.3. Определение биохимических свойств испытуемого

вакцинного штамма туляремийного микроба

1.3.1. Для определения биохимической активности испытуемого и контрольного вакцинных штаммов используют культуры со скошенного агара 2 пассажа. Определение ферментации углеводов (сахара, спирта) проводят в специальной жидкой среде <*> или среде Dawns <**>.

--------------------------------

<*> Состав и приготовление жидкой среды для определения

ферментации углеводов F. tularensis: пептон - 1 г; натрий хлорид

(NaCl) - 5 г; калий гидрофосфат (K HPO ) - 0,3 г; L-цистеин

2 4

гидрохлорид - 0,1 г; феноловый красный - 0,02 г; сахар - 10 г (или

глицерин - 10 мл) на 1 л дистиллированной воды. Смесь подогревают

до полного растворения, остужают, устанавливают рН 7,2, разливают

во флаконы по 100 мл. Стерилизуют автоклавированием при 115 °С в

течение 20 мин. и разливают по 2 мл в пробирки. Пробирки должны

быть химически чистыми и простерилизованными. Цвет среды -

оранжево-красный. Культуру засевают по 1 полной бактериологической

петле и инкубируют при температуре 37 °С до 5 - 6 сут.

<**> Среду Dawns готовят согласно "Руководству по лабораторной

диагностике туляремии" (Иркутск, 1986): мясопептонный агар - 100

мл, цистеин - 0,05 г, индикатор бромтимоловый синий - 0,4 мл

спиртового раствора, глицерин - 1 мл или по 1 г углеводов

(глюкоза, мальтоза, манноза, левулеза). Приготовленную среду

стерилизуют при 112 - 115 °С в течение 20 мин., затем охлаждают до

40 - 50 °С и добавляют 5% (от общего объема) нормальной лошадиной

сыворотки, обязательно устанавливают рН 7,0 +/- 0,1 (подкисляют

соляной кислотой в разведении 1:1 или подщелачивают 20%-м

раствором натрия гидроксида). Цвет среды должен быть зеленым.

После чего готовят скошенные столбики среды в пробирках. Культуру

высевают по 2 - 3 полные бактериологические петли на пробирки со

скошенной средой Dawns с глюкозой, мальтозой, маннозой, левулезой

и глицерином. При положительной реакции цвет среды изменяется на

лимонный.

В случае ферментации углевода цвет среды становится желтым, при отрицательной реакции цвет среды остается без изменений.

1.3.2. Пробы на образование сероводорода и отсутствие выделения индола ставят в соответствии с Инструкцией по применению систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (СИБ) - ФСП 42-0100-3827-03.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм образует сероводород и не выделяет индол.

1.3.3. Определение фосфатазной активности. В 1 мл 0,5%-го водного раствора додецилсульфата натрия готовят микробную взвесь испытуемого штамма туляремийного микроба и добавляют 1 мг фенолфталеиндифосфата. Смесь инкубируют при температуре 37 °С в течение 30 мин. и добавляют 1 каплю 1 N натрия гидроксида.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм не изменяет цвет реакционной смеси.

1.3.4. Определение пенициллиназной активности. Фильтровальную бумагу, смоченную растворами бензилпенициллина (50000 ед./мл) и крезолового красного (1 мг/мл), помещают на дно чашки Петри. На поверхность бумаги наносят каплю микробной взвеси испытуемого штамма туляремийного микроба и 30 мин. инкубируют при температуре 20 °С.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм окрашивает пробы в желтый цвет.

1.3.5. Определение чувствительности к эритромицину. Осуществляют методом дисков по методике, изложенной в "Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" (МЗ СССР, Москва, 1983).

1.4. Определение серологических свойств испытуемого

вакцинного штамма туляремийного микроба

Серологические свойства определяют с помощью пробирочной реакции агглютинации. Реакцию агглютинации испытуемого штамма ставят в соответствии с Инструкцией по применению сыворотки диагностической туляремийной агглютинирующей по ФС 42-3492-98.

ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ СВОЙСТВ ВАКЦИННОГО

ШТАММА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА 15 НИИЭГ

Признак	Наличие признака
Морфология - мелкие кокки	+
Подвижность	-
Окраска по Граму - грамнегативные	+
Рост на питательной среде с 5 - 10% крови белых в SR-форме колоний (% к числу выросших)	Не менее 80
Агглютинабельность сывороткой диагностической туляремийной	До титра
Ферментация глюкозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация мальтозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация маннозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация левулезы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация глицерина	-
Образование сероводорода	+
Выделение индола	-
Чувствительность к эритромицину	-

Приложение 2

(обязательное)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ ИСПЫТУЕМОГО

ВАКЦИННОГО ШТАММА НА БЕЛЫХ МЫШАХ

Определение остаточной вирулентности проводят параллельно для испытуемого и контрольного вакцинных штаммов. Для этого 140 белых мышей массой 18 - 20 г делят на 2 группы методом случайной выборки по 70 животных, 1 группа - для испытуемого штамма, 2 - для контрольного.

Используют двухсуточную агаровую культуру каждого штамма 2

пассажа, выращенную на питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре.

9

Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10 м.к./мл. Затем

последовательно десятикратно разводят в 0,9% растворе натрия

-1 -8 8

хлорида с 10 до 10 , что соответствует от 1 х 10 до 10

м.к./мл, и вводят животным подкожно в заднюю правую лапку по 0,5

6 5

мл приготовленных взвесей, что соответствует 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х

4 3 2

10 , 5 х 10 , 5 х 10 , 50 и 5 м.к. Каждую дозу каждого штамма

вводят 10 животным. Для подсчета LD и расчета вводимых доз

50

-6

производят высев культуры из разведения 10 по 0,1 мл на 5 чашек,

содержащих FT-агар. Гибель мышей учитывают в сроки до 21 сут.

после введения культуры. Животных, павших на 5 - 10 сут.,

вскрывают, обращают внимание на патоморфологические изменения,

производят посев селезенки методом отпечатка на питательную среду

Мак-Коя или FT-агар (посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1)

°С в течение 10 сут., ежедневно просматривая). Если в посевах

обнаруживается рост культуры, ее идентифицируют в РИФ (реакции

прямой иммунофлуоресценции) с иммуноглобулинами диагностическими

флуоресцирующими туляремийными (ФСП 42-0180-5315-04). Гибель мышей

от испытуемого штамма устанавливают на основании

патологоанатомических данных вскрытия (плотный инфильтрат на месте

введения, гиперемия сосудов подкожной клетчатки и паховых

лимфатических узлов, увеличение и уплотнение селезенки) и

выделения из посевов туляремийного микроба.

Вакцинный штамм туляремийного микроба должен обладать

остаточной вирулентностью для белых мышей, LD его должна быть в

50

2 6

пределах от 10 до 2 х 10 м.к.

Величину LD вычисляют по формуле:

50

lg LD = lg D - l (SUM L - 0,5),

50 i

где:

D - максимальная из испытанных доз;

L - отношение числа животных, погибших при введении данной

i

дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

SUM L - сумма значений L , вычисленных для всех испытанных

i i

доз.

Если величина LD для контрольного штамма F. tularensis 15

50

НИИЭГ окажется выше или ниже лимита, контроль повторяют по той же

методике; если величина LD для испытуемого штамма не

50

удовлетворяет требованиям лимита, а контрольного штамма -

удовлетворяет, испытуемый штамм не соответствует требованиям,

предъявляемым к вакцинным штаммам по степени остаточной

вирулентности.

Приложение 3

(обязательное)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ И БЕЗВРЕДНОСТИ

ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА НА МОРСКИХ СВИНКАХ

Оценку безвредности вакцинного штамма туляремийного микроба проводят на здоровом поголовье морских свинок массой 400 - 500 г.

3.1. Перед началом опыта состояние здоровья животных оценивают совместно ветеринарный врач и член комиссии по изучению нового вакцинного штамма туляремийного микроба.

Поступивших животных выдерживают под наблюдением в течение 10 сут. обсервации. Оценку здоровья поголовья морских свинок начинают проводить с клинического осмотра, взвешивания, измерения ректальной температуры (не должна превышать 38 °С). Повторное обследование животных (взвешивание, термометрирование, клинический осмотр) проводят накануне эксперимента (за сутки). Перед подкожным введением культур изучаемого и контрольного штаммов туляремийного микроба животных с учетом показателей массы тела распределяют на равнозначные группы для каждого штамма и каждой группы. На каждый штамм берут по 150 морских свинок - 4 равнозначные группы по 30 животных в каждой и 30 - для контроля. В оценку состояния здоровья морских свинок входят данные патологоанатомического и гистологического исследований. Для этого из каждой группы по 10 животных вскрывают и исследуют в 3 этапа: в начале обсервации, в день начала опыта и через 30 сут. после постановки опыта.

3.2. Распространенность, приживаемость, безвредность и реактогенность культуры испытуемого вакцинного штамма F. tularensis, а также вызываемые им морфологические изменения в органах и тканях животных (морские свинки).

Данные характеристики исследуемого штамма определяют в одном опыте на одной и той же группе животных в сравнении с контрольным штаммом.

В опыте используют двухсуточные агаровые культуры 2 пассажа с

питательной среды Мак-Коя или FT-агара испытуемого и контрольного

3 5 7 9

штаммов. Каждую дозу 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х 10 и 5 х 10 м.к.

(дозы определяют по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО

42-28-85П соответствующего года выпуска) вводят подкожно в правую

паховую область 30 морским свинкам в объеме 1 мл. Для подсчета

LD и расчета вводимых доз производят высев культуры из

50

-7

разведения 10 по 0,1 мл на 5 чашек, содержащих FT-агар.

3.3. Для определения распространенности, приживаемости микробов в органах и тканях, характера патоморфологических изменений, возникающих после введения культур, животных по 3 на каждую дозу поочередно умерщвляют хлороформом на 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 сутки, оставшихся в живых животных умерщвляют на 45-е сут. после введения испытуемых культур. Сразу после умерщвления животных проводят их вскрытие и описание видимых патологоанатомических изменений и бактериологическое исследование внутренних органов, а также забирают органы для патогистологического исследования.

3.4. Вскрытие животных производят общепринятым методом. Для каждого животного берут отдельную банку емкостью 300 - 500 мл с притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненную 10%-м раствором нейтрального формалина. В банку помещают бумажную этикетку, на которой графитовым карандашом четко и крупно написаны с обеих сторон: номер животного, шифр испытуемой культуры, дата взятия материала и день наблюдения. На бумажных этикетках пишут названия органов, которые после вскрытия помещают на них. Затем в банку для каждого животного помещают лимфатические узлы, кусочки органов и тканей вскрытого животного. Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол вскрытия (см. в конце Приложения).X

При вскрытии морских свинок отмечают состояние кожи, подкожной клетчатки, подлежащих мышц в месте введения микробной культуры, характер и распространенность отмечаемых в них изменений. Особое внимание обращают на степень инъекции сосудов подкожной клетчатки, величину отека, на развитие геморрагических, гнойных и некротических изменений. Указывают размеры (в мм) регионарных к месту введения культуры паховых лимфатических узлов, их цвет, плотность, спаянность с окружающими тканями и состояние отдаленных (контрлатеральных) подмышечных узлов. После высева методом отпечатков на плотную питательную среду кусочки ткани с места введения погружают в раствор формалина, а лимфатические узлы помещают на отдельную этикетку (см. выше) и опускают в фиксатор. Затем вскрывают брюшную и грудную полости. Отмечают полнокровие внутренних органов, состояние плевральных полостей, сальника, висцеральной брюшины, кишечника. Из всех внутренних органов (печень, селезенка, легкие, сердце) методом отпечатков производят посевы на поверхность питательного агара. При описании внутренних органов обращают внимание на наличие в легких мелких серовато-розовых очажков или тяжей, расположенных по ходу сосудов и бронхов, в печени и селезенке - узелков и очагов некроза, отмечая их количество, размеры и внешний вид. Увеличение селезенки лучше регистрировать указанием ее размеров (длины, ширины, толщины). Кусочки органов берут обязательно на границе с измененными участками (если они обнаружены) и помещают в банку с фиксатором. После исследования легких, сердца, селезенки, печени и взятия из них кусочков размером 1 х 1 х 1 см тонкий кишечник отодвигают в правую сторону (по отношению к свинке), пинцетом берут почку, надрезая ее, кроме этого для исследования берут надпочечник и подвздошные лимфатические узлы. Отмечают размеры, консистенцию, цвет, а также состояние окружающей клетчатки. Наконец, выделяют мезентериальные лимфатические узлы, расположенные ближе к корню брыжейки, и характеризуют их по схеме, приведенной выше. В последнюю очередь берут костный мозг вместе с кусочком диафиза бедренной кости. При этом кость надо расщепить, т.к. она может препятствовать проникновению фиксатора. Собранный материал помещают в формалин на 14 сут. при температуре 18 - 25 °С. После чего проводят его контроль на специфическую стерильность, затем подвергают дальнейшему гистологическому исследованию.

3.5. Во время вскрытия проводят высевы из органов, тканей и лимфатических узлов на агаровые пластины в чашках Петри с питательными средами FT-агаром, с агаром с 1%-й кровью и агаром Эндо. На агар для выделения туляремийного микроба делают высев из места введения культуры, правого подвздошного лимфатического узла, костного мозга (первая чашка), из лимфатических узлов - правого пахового (регионарного) и левого пахового, правого и левого подмышечного (вторая чашка), из печени и селезенки (третья чашка), из легких и сердца (четвертая чашка). На агар с 1 - 2%-й кровью делают высев из легких и крови, на агар Эндо - из печени и селезенки. Высевы из органов проводят методом множественных отпечатков, костный мозг берут и сеют бактериологической петлей из бедренной кости, посев крови производят мазком - отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Все посевы помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 5 - 7 сут. Погибших в ходе опыта животных исследуют так же, как и умерщвленных. Кроме того, при вскрытии погибших морских свинок дополнительно делают посевы на агар Эндо из тонкого, толстого кишечника и мезентериальных лимфатических узлов. Все посевы просматривают ежедневно, начиная со 2 до 7 сут. инкубирования.

В зависимости от результатов бактериологического исследования могут быть приняты следующие решения по дальнейшему ведению испытаний:

1) Культура туляремийного микроба выделена из всех внутренних органов. Штамм не может быть признан безвредным. Дальнейшие испытания вакцинного штамма следует прекратить.

2) Выделяемая из органов подопытных животных культура испытуемого штамма туляремийного микроба контаминирована посторонней микрофлорой. В этом случае вопрос может быть решен следующим образом:

а) если контаминированная посторонней микрофлорой культура испытуемого вакцинного штамма выделена из органов только нескольких (от 1 - 2 морских свинок из всей группы), то этих животных не учитывают при анализе результатов испытаний и опыт продолжают;

б) если контаминированная посторонней микрофлорой культура испытуемого вакцинного штамма выделена от большого числа опытных морских свинок, то следует считать, что опыт поставлен на неполноценных животных и его необходимо повторить с использованием здоровых морских свинок.

3) Культуру испытуемого штамма из органов подопытных животных выделить не удалось, но на агаровых средах выявлен рост посторонней микрофлоры. Если такой результат получен в высевах из нескольких подопытных животных (1 - 2 морских свинок), то этих животных не учитывают. В том случае, когда посторонняя микрофлора выделена от большого числа животных, опыт повторяют на новой партии здоровых животных.

4) Если штамм удовлетворяет перечисленным требованиям, то он признается вакцинным.

3.6. Методика определения реактогенности вакцинного штамма для

морских свинок. Реактогенность испытуемого и контрольного штаммов

для морских свинок определяют по характеру прижизненных изменений

3 5 7 9

в месте введения 5 х 10 , 5 х 10 , 5 х 10 и 5 х 10 м.к. и в

регионарном лимфатическом узле, по изменению температуры и массы

тела свинок. Наблюдения проводят за животными из опыта по изучению

безвредности, которые согласно плану должны умерщвляться на 30-е

сут. после введения культур. Животных осматривают через 1 - 2; 3 -

4; 7 - 8 и 10 - 11 сут. после введения им испытуемого штамма.

Реакцию на месте введения определяют путем пальпации и измерения

участков уплотнения, инфильтратов, путем определения размеров

лимфатических узлов, их подвижности, болезненности.

Измерение температуры тела проводят ректально или орально с помощью медицинского термометра или другого, подобного ему по технической характеристике.

Массу тела животного определяют с точностью до одного грамма.

3.7. Морфологические изменения у морских свинок изучают

макроскопически и гистологически в динамике после однократного

подкожного введения в правую паховую область культуры испытуемого

3 5 7

штамма в малой (5 х 10 м.к.), средних (5 х 10 и 5 х 10 м.к.) и

9

максимальной (5 х 10 м.к.) дозах двухсуточной агаровой культуры.

Протокол вскрытия

от ___________ г.

N животного ____ вид __________ пол ___________ масса ____________

температура тела _____ доза ________ Название культуры ___________

срок наблюдения _____________ Метод и место введения _____________

Дата: введения __________ гибели ________ умерщвления ____________

Результаты вскрытия

Упитанность ______________________________________________________

Состояние подкожных сосудов ______________________________________

Место введения ___________________________________________________

Лимфатические узлы:

Правый паховый ___________________________________________________

Левый паховый ____________________________________________________

Правый подмыш. ___________________________________________________

Левый подмыш. ____________________________________________________

Подвздошные ______________________________________________________

Паратрахеальные __________________________________________________

Бифуркационные ___________________________________________________

Легкие ___________________________________________________________

Селезенка ________________________________________________________

Печень ___________________________________________________________

Почки ____________________________________________________________

Надпочечники _____________________________________________________

Другие органы ____________________________________________________

__________________________________________________________________

Костный мозг _____________________________________________________

Подпись Дата

Статистический анализ всех полученных результатов осуществляют с определением средних величин показателей и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95% (И.П. Ашмарин и А.А. Воробьев, 1962).

Приложение 4

(обязательное)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА НА МОРСКИХ СВИНКАХ

Стабильность биологических свойств культуры испытуемого вакцинного штамма туляремийного микроба определяют после 10-кратных пассажей ее на морских свинках массой 400 - 450 г при подкожном способе введения.

Для первого пассажа используют двухсуточную агаровую культуру

испытуемого штамма второй генерации, выращенную на среде Мак-Коя

9

или на FT-агаре. Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10

м.к./мл (как описано в Прилож. 1) и шприцем объемом 5 мл вводят по

1 мл в правую паховую область 2 морским свинкам. Через 4 сут.

животных умерщвляют хлороформом и вскрывают. Для последующего

пассажа у умерщвленных животных забирают регионарные (паховые)

лимфатические узлы и селезенку (400 - 500 мг), помещают их в

фарфоровую ступку с 1 - 2 г стерильного мелкого речного песка и

растирают пестиком до гомогенного состояния.

Затем в ступку вносят 5 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и суспендируют гомогенат; дают осесть крупным кусочкам тканей и песку на дно ступки, надосадочную жидкость забирают шприцем и вводят подкожно в правую паховую область по 0,5 мл 2 морским свинкам (второй пассаж). Параллельно делают посев суспензии на скошенную питательную среду в пробирках Мак-Коя или FT-агар для подтверждения наличия культуры испытуемого штамма F. tularensis. Посевы помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение 2 сут. Аналогично второму пассажу проводят пассажи с третьего по десятый, каждый раз на двух свинках и с параллельным высевом на питательную среду. Если в каком-либо из пассажей культура не выделяется, в дальнейшем используют культуру, полученную на питательной среде от предыдущего пассажа.

Субкультуру, выделенную после десятого пассажа, а также все субкультуры, выделенные от погибших животных и умерщвленных с явлениями генерализации, параллельно с культурой контрольного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ изучают: по культурально-морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам, безвредности (по методике, описанной в Прилож. 1).X

Безвредность определяют по укороченной схеме для морских

5 9

свинок (дозы - 5 х 10 и 5 х 10 м.к.) и по полной схеме для белых

мышей; вскрытие и исследование животных проводят на 7, 14 и 21-е

сут. после введения. Методика исследования - в соответствии с

Прилож. 3. Культура испытуемого вакцинного штамма F. tularensis

после 10 пассажа должна быть стабильной и типичной по

вышеперечисленным признакам в соответствии с Прилож. 1 и 2.

Приложение 5

(обязательное)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИСПЫТУЕМОГО ВАКЦИННОГО

ШТАММА НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ МОРСКИХ СВИНОК

Методика подготовки испытуемого штамма для данных определений аналогична описанной в Прилож. 1.X

Влияние испытуемого штамма на иммунную систему определяют на

морских свинках массой 300 - 400 г. Экспериментальных животных

3

иммунизируют однократно подкожно согласно Прилож. 3 дозами 5 х 10

4

м.к. и 5 х 10 м.к. односуточной агаровой культурой испытуемого и

контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба 15 НИИЭГ. Для

проведения исследований по нижеперечисленным тестам каждую дозу

испытуемого и контрольного штаммов вводят 10 животным.

Одновременно 10 морским свинкам вводят плацебо - 0,9%-й раствор натрия хлорида.

Группы животных формируются методом случайной выборки равнозначных по полу и массе. Иммунологические исследования проводят через 1, 3, 7, 14 и 28 сут. после введения испытуемого штамма. При обнаружении изменений в показателях необходимо срок наблюдения продлить до восстановления изучаемых показателей до исходного уровня и (или) уровня в контрольных группах.

Проводят следующие виды исследований в соответствии с РД 42-28-10-90 и "Медицинскими лабораторными технологиями" (Справочник, 2002). Животных для данных опытов используют тех же, что и для определения безвредности, реактогенности и приживаемости штамма (Прилож. 3).X