• Приготовление гистологических объектов

Гистологические объекты могут быть представлены фиксированными или живыми клетками и тканями, для приготовления которых применяют различные методы исследования.

По способу приготовления различают следующие виды гистологических препаратов: срезы тканей органов (толщиной от 5 мкм и более); мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (например, селезенки); пленочные, или тотальные препараты. К ним могут быть отнесены кровь, лимфа, половые клетки, зародыши ранних стадий развития, тонкие пленки тканей растений и животных.

Чаще всего используются срезы. В этом случае приготовление препарата включает пять этапов:

1) взятие и фиксация материала,

2) обезвоживание и уплотнение (заливка) материала,

3) приготовление срезов,

4) окрашивание срезов,

5) заключение срезов в консервирующую среду

Процесс приготовления гистологического среза для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:

Взятие материала: Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. При этом используется метод микрохирургии, который нужен для проведения экспериментов на клетках, тканях и зародышах в гистологии и эмбриологии. При помощи таких микроопераций можно, например, выделить из ткани отдельную клетку, удалить из клетки ядро, перенести ядро из одной клетки в другую или переместить часть клеток зародыша, разъединить бластомеры дробящегося яйца. Все эти эксперименты осуществляются при помощи прибора, который называется микроманипулятором. В состав этого прибора входят микроскоп, система рычагов с различной степенью плавного регулирования. К рычагам присоединяются миниатюрные инструменты: стеклянные капилляры, иглы, крючки.

Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации.

Фиксация — воздействие химическими или физическими агентами (формальдегид, спирт, четырехокись осмия, замораживание и др.), вызывающее процесс необратимой коагуляции белков и прекращающее процессы жизнедеятельности. Выбор способа и длительности фиксации зависит от задач исследования и особенностей объектов исследования (проницаемость тканей для различных фиксаторов неодинакова).

Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.

Существуют фиксаторы простые и сложные. К простым относятся 10-20% раствор формалина, 96 º спирт, 100 (абсолютный) спирт, 1-2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт – формол (спирт 70º — 100 мл. и формалин 2-5 мл.) жидкость Ценкера (сулема – 5 г, сернокислый натрий — 1 г., двухромовокиолый калий – 2,5 г, дистиллированная вода – 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др. Продолжительность фиксации – от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.

После применения некоторых фиксаторов (формалин, сулема и др.) материал нужно промыть в воде, а затем удалить воду с помощью спиртов возрастающей крепости (от 60° до 100°), т.е выполнить обезвоживание.

Заливка (затвердение) материала производят либо путем замораживания, либо путем пропитывания специальными затвердевающими средами— парафином, целлоидином (для световой микроскопии), синтетическими смолами (для электронной микроскопии). Для лучшего проникновения этих уплотняющих веществ в клетки и ткани используются растворители (ксилол, хлороформ, эфир и др.).

При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол).

При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду.

Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.

Д ля быстрого изготовление высококачественных парафиновых блоков, что в свою очередь облегчает изготовление качественного информативного среза, используют специальные станции для заливки. (Рис. 1.4)

Рис. 1.4 Станция для заливки парафином EC-350

Рис. 1.5 Автоматический микротом с системой переноса срезов STS

Приготовление срезов (парафиновых и целлоидиновых) производят с помощью специальных приборов — микротомов (Рис. 1.5), из замороженных кусочков— с помощью криотомов (в криостатах). Парафиновые, целлоидиновые и замороженные срезы имеют толщину 4—20 мкм, полутонкие — 1—2 мкм, ультратонкие — 400—800 нм. Срезы толщиной 4—20 мкм готовят на санных или ротационных микротомах, полутонкие и ультратонкие — на ультрамикротомах с использованием стеклянных ножей.

Для быстрого получения срезов (экспресс-гистологическая диагностика) используют замораживающий микротом и криостат.

Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания.

Под углом наклона понимают угол, образуемый нижней поверхностью ножа с плоскостью резания. Наилучшим считается такой угол наклона, при котором плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Обычно он равен 13—15°. Если нож установлен так, что угол наклона больше оптимального, то срез будет крошиться, если меньше — резка невозможна, так как лезвие ножа будет лишь скользить по поверхности блока.

Под углом резания подразумевают угол между длинной осью ножа и воображаемой линией, идущей через центр блока параллельно движению салазок, несущих нож. Величина угла резания зависит от свойств обрабатываемого материала: чем он мягче, тем угол меньше, и, наоборот, чем тверже, тем угол больше. При косом расположении ножа уменьшается сопротивление его режущего края поверхности блока, что облегчает резку мягких блоков. Максимальный угол резания равен 90°, минимальный — 20—30°.

При выборе ножей для замораживающих микротомов и ножей для изготовления парафиновых или целлоидиновых срезов следует руководствоваться рекомендациям изготовителей. Эти ножи обычно снабжены съемными надобушниками, приспособленными дли их точки. При помощи такого надобушника задается нужный угол скоса лезвия. Обычно вместе с ножом поставляются также держатели, которые можно укреплять, на основании ножа с помощью пинтового крепления.

В гистопатологических лабораториях препараты следует надписывать перед окрашиванием. Для этого можно применять алмазный карандаш, однако после нанесения таких пометок предметные стекла довольно часто бьются во время и после окрашивания. Парафиновые блоки удобно метить, прикрепляя к одному их краю при помощи нагретого утюга небольшую бумажную этикетку с надписью. сделанной тушью.

Изготовленные на микротоме срезы затем окрашиваются.