28.Производство и использование тест-препаратов в гибридомной технологии.

Введение антигена (бактерий, вирусов и т. д.) вызывает обра­зование разнообразных антител против многих детерминант антигена. В 1975 г. Г. Кёлер и К. Милыптейн (лауреаты Нобе­левской премии) получили моноклональные антитела с помощью гибридомной технологии.

Моноклональные антитела — это иммуноглобулины, синтези­руемый одним клоном клеток. Моноклональное антитело связы­вается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

Гибридомная технология — слияние с помощью полиэтиленгли-коля лимфоцитов селезенки предварительно иммунизированных организмов определенным антигеном с миеломными (раковыми) клетками, способными к бесконечной пролиферации (делению). Гибридные клетки селекционируют в среде ГАТ (среда, содержа­щая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Неслившиеся лим­фоциты погибают в любой тканевой культуре. Миеломные клетки на этой среде также погибают, так как они были дефектны по ГГФТ (гипоксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазе). Отби­рают клоны клеток, синтезирующие необходимые антитела. Нужные клоны можно хранить в замороженном состоянии.

Таким образом, гибридомы представляют собой бессмертные клоны клеток, синтезирующие моноклональные антитела.

Получение и использование моноклональных антител — одно из существенных достижений современной иммунологии. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество. В медицине меченные изотопами или иным способом монокло­нальные антитела можно использовать для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Получены моноклональные антитела к различным возбудителям: малярии, трипаносомозу, лейшманиозу, токсо-плазмозу и др. Ученые считают, что в самом ближайшем буду­щем моноклональные антитела займут доминирующее положе­ние в диагностике болезней. Для использования в терапии моно­клональные антитела можно соединять с лекарством (например, с токсическими веществами) благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам

или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Можно использовать моно­клональные антитела (против Н — Y-антигена) для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развития, а также для стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мем­бран (так были изучены антигены Т-лимфоцитов), для постро­ения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней.

5.Секвенирование (сиквенс) геномов и фрагментов днк.

Грубо говоря, сиквенс - это результат секвенирования ДНК либо РНК. Техника секвенирования совершенствуется уже более 30 лет, начиная с 70х, когда пользовались радиоактивной меткой (и на секвенирование даже коротких фрагментов уходили недели), вплоть до перспективных методов последних лет, дозволяющих читать миллионы оснований за очень короткое время.

"Классическая" последовательность манипуляций заключается в постановке ПЦР (полимеразной цепной реакции) и последующем чтении ДНК на секвенаторе. ПЦР во многом аналогична естественному процессу репликации ДНК, с той разницей, что продуктом реакции является новая одинарная цепь вместо двойной. Перед началом реакции с помощью нагревания добиваются денатурации - расплетания цепей исходного образца ДНК. Как и естественная репликация, рост цепи при ПЦР начинается с праймера - короткого, но вместе с тем уникального, заранее синтезированного, фрагмента каждой цепи на ее 5'-ом конце, который станет началом новой цепи, растущей в направлении 3'-го конца. Для реакции используются специальные термостойкие полимеразы, способные сохранить активность при повышенной температуре. Целью ПЦР является увеличение количества ДНК в миллионы раз, чего добиваются многократным повторением циклов, каждый из которых дает увеличение количества в два раза. С учетом того, что следующим этапом будет секвенирование, в состав нуклеотидов, из которых строятся новые цепочки, подмешивается определенное количество т.н. "терминаторов" - модифицированных молекул, к 3'-му концу которых не способны присоединяться новые. При этом каждый такой нуклеотид метится особым флуоресцентным красителем, чтобы при возбуждении лазером детектор мог легко распознать основание (A, G, T, C) по длине волны. Готовый ПЦР-продукт разгоняется в геле, как при электрофорезе, и, двигаясь по тонкому капилляру, проходит зону сканирования, где луч лазера улавливается детектором, передающим тип прочтенного основания управляющему компьютеру. Правильный порядок "чтения" гарантируется тем, что чем короче фрагмент, т.е. чем ближе к 5'-му концу исходного продукта вместо нормального нуклеотида присоединился терминатор, тем быстрее фрагмент "добежит" до сканера.

Описанная классическая схема позволяет читать лишь относительно короткие фрагменты ДНК - порядка 1-2 kbp, и до недавнего времени она была единственно доступной. Также оговоримся, что здесь мы ограничились только описанием процедуры, использующей специфические праймеры, то есть перед тем, как ставить ПЦР и секвенировать некоторый фрагмент, нужно неплохо знать, как выглядят его концы. Есть и более универсальные методы, применяемые при тотальном секвенировании больших участков генома, их мы здесь касаться не будем. Заметим только, что "специфичность" праймера отнюдь не значит, что реакция пройдет только в том случае, если в геноме найдется участок, полностью комплементарный последовательности прайиера. Праймеры намеренно синтезируют таким образом, чтобы они могли присоединяться и к мутировавшим участкам; такие праймеры, обычно подходящие для всех индивидов в пределах вида, называют "консенсусными".

Прочитанная последовательность ДНК, ограниченная двумя праймерами, называется сиквенсом. Как мы уже заметили в предыдущем разделе, отвлекаясь от химической структуры, с математической точки зрения подобные цепочки можно рассматривать как последовательности букв A, G, T и C, снабженные ориентацией, обычно от 5' к 3'. Существует масса способов хранения таких последовательностей в электронном виде, начиная от простой строки и заканчивая сложными форматами, где фрагменты нуклеотидного "текста" дополняются различными аннотациями для разъяснения его биологического "смысла", если таковой известен.

Наиболее крупным онлайн-хранилищем сиквенсов является Генбанк, откуда любой сиквенс можно экспортировать во множестве форматов, включая FASTA.

К сожалению, иногда встречаются случаи, когда даже современное оборудование по каким-либо причинам не в состоянии прочитать тот или иной нуклеотид в последовательности, возвращая результат вроде "A или G" или даже "A, G, T или С". Вспомним также, что в одном из предыдущих разделов мы говорили о гетероплазмии в мтДНК, то есть одновременном присутствии в геноме нескольких вариантов нуклеотидов в одной и той же позиции. Во время ПЦР и секвенирования будут размножены и прочитаны практически все виды цепочек, ограниченных выбранными праймерами, поэтому даже идеальное оборудование может (и должно) вернуть результат неопределенного вида.

Можно сказать, что использование праймеров является естественной "химической" формой адресации внутри генома. Так, вместо "25-ая позиция такого-то участка такой-то хромосомы" с практической точки зрения удобнее указать последовательность в непосредственной близости от искомой точки, достаточно длинную, чтобы быть уникальной во всем геноме данного вида, и достаточно "гибкую", чтобы благодаря использованию расширенного алфавита IUPAC покрывать все эволюционные формы рассматриваемого участка у вида, и затем "адресовать" искомую точку, отсчитав от конца последовательности, например 3'-го, определенное число позиций.