1.2 Диагностика бешенства

Таблица 1

Общая схема диагностики бешенства

До лабораторные методы
Эпизоотологический		Клинический		Паталогоанатомический
Благополучие местности по бешенству в прошлом. Наличие покусов домашних и сельскохозяйственных животных дикими хищниками, собаками, кошками. Наличие трупов диких животных. Учитывают анамнестические данные о нападении подозрительного животного.		Не обычное поведение диких животных, отсутствие у них страха перед человеком. Возбуждение, извращенный аппетит, параличи мышц гортани, шеи, нижней челюсти, конечностей.		Истощение, цианоз слизистых оболочек, плохое свертывавание крови. В головном и спином мозге острая гиперемия, отек.
Лабораторные методы
вирусологический	биологический		серологический		Патогистологический
Микроскопическое исследований срезов либо мазков-отпечатков головного мозга на обнаруже- ние телец Бабеше-Негри, обнаружение рабического антигена методом имунофлуорисценции	Заражение лабораторных животных (белых мышей, кроликов, морских свинок, хомячков.		РСК, ИФА, РП, РН, РТГА		Диссеминированный негнойный полиэнцефаломиелит лимфоидного типа
Диагноз на бешенство считается положительным при получении одного из следующих показателей: 1 выявлении при микроскопии в мазках отпечатках или гистопрепаратах внутриклеточных включений телец Бабеше-Негри. 2 обнаружение в нескольких полях зрения микроскопа при исследовании отпечатков при помощи метода флуоресцирующих антител не менее 10 типичных гранул с ярким зеленым свечением.

В лабораторию направляют голову с двумя шейными позвонками или головной мозг крупных и средних животных. Доставляют свежий труп мелких животных. Строго выполняют правила взятия патологического материала. Отбор мозга, другие операции с патологическим материалом следует выполнять в условиях стерильности, тщательного соблюдения правила личной безопасности. Для отбора патологического материала прочно фиксируют голову. Кожу после разреза по средней линии и поперечных разрезов отодвигают в сторону, отрезают мышцы. Затем удаляют свода черепа с помощью пилы для костей или долота, стерильными инструментами извлекают мозг, который помещают в банка с притертой стеклянной пробкой или капроновой крышкой. Консервированный мозг для вирусологических исследований непригоден.

Банки с мозгом, свежий труп или голову животного тщательно упаковывают в полиэтиленовые мешки, которые помещают в влагонепроницаемую тару, плотно закрывается, с влагопоглащающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Упакованный патологический материал и сопроводительное письмо отправляют с посыльным. В сопроводительном письме указывают адрес лаборатории ветеринарной медицины, в которую направляют материал, название материала, вид и номер животного, дату иммунизации ее против бешенства; анамнестические данные: отмечают всех пострадавших и, кто контактировал с животным; называют отправителя, его адрес, дату отправления, фамилию врача ветеринарной медицины[7,16,10].

Индикация и идентификация вируса. С каждого отдела головного мозга готовят по 2 мазки для ИФА и для обнаружения телец Бабеша - Негри в световом микроскопе, с мозговой тканью проводят реакцию диффузионной преципитации , при отрицательных результатах проводят биопробу.

Выявление специфических телец - включений. Мазки фиксируют не менее 2 ч в этиловом спирте и окрашивают по Муромцеву, по Селлеру. После окраски препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсией. Положительным результатом считают наличие специфических телец Бабеша - Негри(при окраске по Селлеру - четко очерченные или продолговатые гранулярные образования розово - красного цвета в протоплазме, при окраске по Муромцеву - светло - фиолетовые с темно - синими включениями тельца Бабеша - Негри, чаще они расположены вне нервных клеток).

Тельца Бабеша - Негри выявляют лишь в 65 - 85 % исследуемых пробах, отобранных от животных, больных бешенством, поэтому их отсутствие не исключает бешенство, материал исследуют с помощью других тестов ( РИФ , РДП , биопроба ) [16,10].

Реакция иммунофлюоресценции ( РИФ) - один из основных тестов диагностики бешенства. Однако в РИФ нельзя исследовать материал от привитых против бешенства животных в течение 3 мес.

Обычно в диагностической практике используют прямой метод иммунофлуоресценции с применением антирабического флюоресцирующего иммуноглобулина. С различных отделов мозга готовят по 2 тонких мазка, фиксируют препараты в охлажденном ( минус 8 - минус 20 ° С ) ацетоне в течение не менее 4 ч. Фиксированные мазки высушивают на воздухе, наносят флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажной камере в термостат при температуре 37 ° с на 30 мин, тщательно пропромывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН = 7,4 и споласкивают дистиллированной водой. После высушивания на воздухе наносят иммерсионное масло, просматривают мазки в люминесцентном микроскопе, оценивая интенсивность свечения комплекса антиген - антитело.

Антиген вируса бешенства проявляется в виде ярких желто - зеленых или зеленых, различной формы и размера гранул в клетках или вне клеток. Диагноз считают установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживают не менее 10 типичных гранул округлой и овальной формы с ярким зеленым свечением или находят множество мельчайших точек свечения. Интенсивность свечения оценивается в плюсах. Отсутствие специфического свечения считают отрицательным результатом .

В контрольных препаратах с мозга здоровой мыши обнаруживают тусклое серое или слабое зеленоватое свечение [7,10,14].

Реакцию диффузной преципитации при диагностике бешенства проводят не только со свежим мозгом животных, но и с тем, что загнивает. Пробы, отобранные из различных отделов головного мозга (мозг мышей берут целиком), объединяют и растирают в ступке. Полученную гомогенную массу помещают в центральные лунки 1,5 % - го агарового геля на предметных стеклах или в чашках Петри. В периферические лунки пастеровской пипеткой наливают антирабический иммуноглобулин в двукратных разбавления от 1: 2 до 1: 16 . После выдерживания агара внесенным компонентами во влажной камере в термостате (37 ° С ) в течение 6 ч или при комнатной температуре в течение 18 ч вычисляют результаты. Окончательно оценивают результаты за 48 час. В положительных случаях наблюдаются линии преципитации между лунками с антигеном и разбавления антирабичного иммуноглобулина. Отрицательные результаты этих исследований не вы подключают бешенства. Выявление антигена составляет 45 - 70 %.

Биопробу проводят на 6 - 10 белых мышатах массой 8 - 10 г. и на 4 кроликах массой 1,5 кг. Которых заражают интрацеребрально и подкожно надосадочной жидкостью 10% - ной суспензии мозга. В случае положительного результата биопробы мышей заболевают и погибают через 7 - 15 суток после заражения, кролики - через 16 - 21 сутки. Головной мозг погибших или убитых подсосных животных исследуют на наличие телец Бабеша - Негри по РИД или РДП. В сомнительных случаях ставят реакцию нейтрализации на мышатах .

Для диагностики бешенства в последние годы в некоторых лабораториях референс - центров МЭБ и ВОЗ разработали и используют твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ ИФА) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Недосеков В. В. в опытах использовал реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), сэндвич - вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) и метод иммунопероксидазного анализа (МИПА).

При постановке РПИФ на предметных стеклах делали по 4 отпечатка аммонова рога, фиксировали их 1 час в ацетоне при минус 20 С, высушивали, затем помещали во влажную камеру, наносили по 0,1 куб.см. рабочего разведения антирабических поликлональных иммуноглобулинов, коньюгированных с флюоресцеинизатиоционатом (ФИТЦ - коньюгат), и 30 мин инкубировали при 37 С. Стекла с отпечатками отмывали 0,01 М фосфатно - буферным раствором (ФБР) с 0,05% - ным содержанием Твина - 20 (ФБР - Т), учитывали результаты, используя люминисцентный микроскоп Olympus. Диагноз на бешенство считали установленным, если в нескольких полях зрения обнаруживали не менее 19 типичных гранул с высокой интенсивностью свечения.

Для постановки ТФ ИФА в пластину и иммобилизироваными в лунках поликлональными (ПА) или моноклональными (МА) антителами вносили по 0,1 куб.см. ФБР - БСА на лунку содержащие исследуемый материал и контрольные образцы (отрицательный и положительный антигены). Пластины 40 мин. Инкубировали при 37 С, трижды отмывали ФБР - Т, затем в лунки вносили по 0,1 куб.см. ФБР, содержащего пероксидазный конъюгат МА или ПА в рабочем разведении, инкубировали 40 мин при 37 С, 6 - кратно отмывали ФБР - Т, вносили по 0,1 куб.см. хромогенного субстратного раствора (ABTS), 30 мин. Инкубировали при комнатной температуре, после чего результаты учитывали фотометрически. Реакцию считали положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых ингибировали исследуемые и специфический (положительный) антиген, в 2 и более раз превышала ОП субстрата, в котором ингибировали нормальный (отрицательный) антиген.

При постановке иммунопероксидазного анализа использовали отпечатки мозга животных, подготовленные как и для РПИФ. Для подавления эндогенной пероксидазы отпечатки инкубировали 20 мин с 0,1% - ной перикисью водорода, тщательно отмывали ФБР - Т, затем на их поверхность наносили по 0,1 куб.см. рабочего разведения пероксидазного коньюгата, помещали на 40 мин. В термостат при 37 С, отмывали 0,01 М ФБР - Т, наносили по 0,1 куб.см. хромогенного субстрата (Corbosol), инкубировали 30 мин., ополаскивали дистиллированной водой и проводили световую микроскопию. О специфическом связывании коньюгата с антигенами вируса бешенства в инфицированных клетках мозга свидетельствовало интенсивное красно - коричневое окрашивание в виде гранул в местах локализации антигена вируса в цитоплазме пораженных нейронов (положительный результат)[9].

Разработанный Недосековым В. В. набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции и иммуноферментного анализа, позволяет обнаруживать антигены вируса и дифференцировать их от гетерологичных. Применяя данный набор препаратов, диагноз можно поставить за 4 сут. до появления клинических признаков болезни и в течение 6 сут. после гибели животных и хранения материала при 20 - 25 С. Использование его позволят применять для диагностики бешенства несколько тестов, что значительно повысит эффективность диагностики болезни .

Кроме этого Виталий Нестеров провел сравнительный анализ существующих анализ существующих методов определения антирабираческих антител и доказано, что оптимальным вариантом для оценки вируснейтрализующих антител является RFFIT (тест быстрой ингибиции фокусов флюоресценции в культуре клеток).

Установлено, что метод характеризуется простотой исполнения, безопасностью, высокой чувствительностью, продуктивностью и экономичностью. Это позволяет рекомендовать его для оценки вируснейтрализующих антител в сыворотках крови вакцинированных животным[8,10, 16].