Загальна характеристика[ред. • ред. Код]

Саузерн-блот комбінує агарозний гелевий електрофорез, що використовується для розділення фрагментів ДНК за розміром, з методами переносу розділеної за розміром ДНК на мембрану і гібридизації. Метод названий на честь його винахідника, британського біолога Едвіна Саузерна^[1]. Інші методи блоту (тобто вестерн-блот, нозерн-блот та саузвестерн-блот) використовують подібний принцип, але для визначення кількісного складу певної послідовності РНК або білків, та були названі пізніше за аналогією із Саузерн-блотом (від англ. southern, nothern, western — «південний», «північний», «західний»). Оскільки тільки Саузерн-блот названий за власним іменем, ця назва повинна писатися з великої букви, але не назви нозерн- чи вестерн-блотів.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення і визначення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

Принцип дії Необхідні компоненти

Малюнок 1: Типовий ампліфікатор для ПЛР

Метод заснований на багатократному виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів in vitro (в штучних умовах). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє задані умови, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку.

За допомогою ПЛР зазвичай можуть бути ампліфіковані відносно короткі (до 10 kbp) ділянки ДНК з відомими кінцями, у окремих випадках можуть використовуватися ділянки до 40kbp. Для проведення найпростішої ПЛР потрібні такі компоненти:

• ДНК-матриця, тобто фрагмент ДНК, що містить ту ділянку, яку потрібно ампліфікувати.

• Два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагменту.

• Термостабільна ДНК-полімераза.

• Дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T).

• Буферний розчин.

ПЛР проводять в ампліфікаторі — приладі, що забезпечує періодичну та швидку зміну температури (охолоджування і нагрівання) тестових пробірок із розчином, зазвичай з точністю не менше за 0,1 °C.

Клонування ДНК

Перша проблема, котра постає перед дослідником, – це отримання в достатній кількості предмета свого дослідження. Ефективним підходом, що дозволяє розмножити будь-який конкретний фрагмент ДНК, є техніка клонування цієї ДНК у бактеріальних клітинах: фрагмент, що цікавить, вбудовується у ДНК-вектор з утворенням рекомбінантної молекули ДНК, яка вводиться у клітину (так звана трансформація). Далі залишається зачекати зростання бактеріальної культури – бактерія використовується як своєрідний біореактор.

Як вектор часто використовують бактеріальні плазміни – порівняно невеликі циркулярні молекули ДНК, що існують у клітині незалежно від бактеріальної хромосоми. Основними вимогами до плазміди як вектора є наявність у її складі ориджина реплікації, унікального (одного на плазміду) сайта, що впізнається певною рестриктазою, і гена стійкості до одного з антибіотиків (рис. 1).

Рестриктази – специфічні до невеликих елементів послідовності ендонуклеази, що здійснюють розрізання обох ланцюгів ДНК. Назви рестриктаз (існує кілька сотень таких ферментів) утворюють за таким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму, дві маленькі – вид, римські цифри та іноді великі літери – порядковий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Наприклад, EcoRI – рестриктаза RI із Escherichia coli. Сайтом рестрикції, що впізнається рестриктазою, є невеликі (чотири, шість, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності