Часть 3. Методы количественного анализа.

При проведении биохимических анализов в клинико-диагностических лабораториях пользуются количественными методами определения компонентов в биологических жидкостях. К этим методам относятся:

1. Весовой (гравиметрический) анализ, основанный на выделении вещества, высушивании и точном взвешивании. Например, определение содержания фибриногена по методу Рутберг.

2. Объемный (титриметрический) анализ, основанный на точном измерении объемов реагирующих между собой веществ в равных количествах. Например, определение кислотности желудочного сока титриметрическим способом.

3. Электрообъемные (электроаналитические) методы, основанные на электрохимических свойствах растворов: потенциометрия, полярография и др. Например, определение концентрации ионов водорода, хлора, натрия, кальция с помощью ионоселективных электродов.

4. Оптические методы, включающие рефрактометрию, поляриметрию и фотометрию. К фотометрическим методам относятся: 1) абсорбционная фотометрия (включает фотоэлектроколориметрию, спектрофотометрию, нефелометрию и турбидиметрию) 2) эмиссионная фотометрия (включает флюориметрию и плазменную фотометрию).

Из методов разделения биологического материала наиболее перспективными являются: электрофорез, иммунный электрофорез, хроматография и ультрацентрифугирование.

Абсорбционный фотометрический анализ

основан на физико-химическом свойстве вещества избирательно поглощать монохроматический (определенной волны) поток световой энергии. Приборы, предназначенные для абсорбционной фотометрии, называются оптическими анализаторами или фотометрами. К фотометрам относятся фотоэлектроколориметры (ФЭК) и спектрофотометры (СФ). Фотоэлектроколориметрами (колор – цвет, метрия – измеряю) называют приборы, предназначенные для измерения при длине волны в видимой области спектра (400-800 нм). Анализаторы, позволяющие работать как в видимой, так и в невидимой области спектра, называются спектрофотометрами (СФ) (они дают возможность проводить измерения в ультрафиолетовой (190-400 нм), в видимой (400-800 нм), в инфракрасной (800-2000 нм) областях спектра).

Принцип колориметрии основан на измерении интенсивности окраски раствора анализируемого вещества. С помощью ФК (или СФ) определяют оптическую плотность (D^*) исследуемого раствора. *Часто в инструкциях к наборам реактивов оптическую плотность обозначают «А»- абсорбция, или «Е» - экстинция.

Основной закон колориметрии (закон Бугера-Ламберта-Бера): оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту поглощения:

D = -lgT% = ε·c·l, где T% - коэффициент светопропускания; ε (л/(моль·см)) – молярный показатель поглощения (равен оптической плотности раствора с концентрацией 1 моль/л при длине кюветы 1 см), с – концентрация определяемого вещества, l – длина слоя раствора, через который проходит свет.

Фотометрические методы биохимического анализа

Измерение по калибровочной кривой. Правила построения калибровочного графика. Для построения калибровочных графиков используют несколько известных концентраций определяемого вещества. Обычно используют четыре-пять различных концентраций (калибровочных точек) стандартного раствора измеряемого вещества. Для каждой концентрации согласно методике определяют оптическую плотность (D). На оси абсцисс откладывается концентрация С, а на оси ординат – плотность D. Наносят точки на систему координат и через скопление точек наилучшим образом проводят линию – калибровочный график. Если закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается, то график будет иметь вид прямой линии, проходящей через нулевую точку (рис. 1).

D (E)

C₁ C₂ C₃ C₄ C₅ Концентрация (С)

Рис. 1. Вид калибровочного графика при линейной зависимости оптической плотности от концентрации исследуемого вещества.

Концентрацию исследуемого вещества в опытной пробе находят прямо по графику, или по формуле: С_опыта = D_опыта · F, где F - это калибровочный коэффициент (фактор): F = C_{cтандарта} / D_{cтандарта}

Расчеты по калибровочным графикам обычно используют для методов, для которых имеются стабильные результаты изо дня в день (гемоглобин, общий белок).

Обучающая задача для самостоятельного решения. При определении общего белка в лаборатории пользуются калибровочным графиком. Для построения калибровочного графика из основного стандартного раствора белка (100 г/л) готовят ряд рабочих стандартных растворов, как указано в таблице 1. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл биуретового реактива. Через 30-60 мин замеряют экстинцию (Е) стандартных проб против биуретового реактива при длине волны 540-560 нм. Задание: 1. Построить калибровочный график на миллиметровой бумаге; 2) рассчитать концентрацию общего белка в исследуемой сыворотке крови, если получена экстинция Е_оп= 0,48; 3) Вычислить фактор пересчета F и использовать его для расчета концентрации белка в исследуемой пробе: 4) сравнить полученный результат с нормой и сделать вывод (норма для общего белка в сыворотке крови у взрослых – 65-85 г/л).

Таблица. Данные для построения калибровочного графика для определения общего белка сыворотки крови.

№ пробирок	Концентрация белка в стандартном растворе, г/л (С)	Экстинция Естандарта
1.	40,0	0,26
2.	50,0	0,33
3.	60,0	0,40
4.	70,0	0,45
5.	80,0	0,51
6.	90,0	0,58
7.	100,0	0,65

Решение:

1. На миллиметровой бумаге строят калибровочный график. Вычерчивается система координат из двух взаимно перпендикулярных осей: абсцисс х и ординат у. На оси абсцисс (горизонтальной) откладывают значения концентрации вещества, а на оси ординат (вертикальной) – значения экстинций. Масштаб выбирают так, чтобы калибровочный график в системе координат располагался под углом в 45^о либо близко к этому значению. Такое расположение калибровочной кривой считается оптимальным. Для этого значения концентраций и соответствующих им экстинций откладываются в одних и тех же удобно выбранных отрезках длины в сантиметрах. Например, максимальная концентрация общего белка, равная 100 г/л, откладывается в 10 см, а соответствующая ей экстинция, соответствующая 0,65, также откладывается в 10 см. Исходя из этого, рассчитывается масштаб в сантиметрах для каждой рабочей концентрации белка и каждой полученной экстинции. К каждой из осей координат в отмеченных точках проводят перпендикуляр. В месте пересечения двух перпендикуляров взаимосвязанной пары (концентрация - экстинция) ставится карандашом точка. Если серия калибровочных (стандартных) растворов состояла из 7 рабочих растворов, то и таких точек, соответственно, получается 7. Затем все полученные точки соединяются прямой линией, выходящей из нуля координат. Если точки не располагаются строго на прямой линии, то линия проводится в среднем положении между несколькими точками, незначительно отклоняющимися от прямой.

Е

0,7

Е_опыта

С_опыта 100 белок, г/л

2. Для расчета концентрации общего белка в исследуемом образце сыворотки крови находим на оси ординат значение Е_оп=0,48 и опускаем перпендикуляр на ось абсцисс, точка пересечения будет соответствовать концентрации общего белка в исследуемом образце - 73,3 г/л.

3. Для удобства в работе на основе калибровочного графика рассчитывают фактор (калибровочный коэффициент) пересчета F. Его вычисляют делением каждой концентрации рабочего стандарта на соответствующую ей экстинцию: F = C_cт /E_ст. Таких факторов получается столько, сколько было концентраций рабочего стандарта. Вычисляют средний арифметический фактор F_ср. Затем с его помощью составляется калибровочная таблица, где против каждого возможного значения экстинции опытных проб указывается соответствующая ей концентрация исследуемого компонента, рассчитанная по формуле: С_оп = Е_оп · F_ср. В нашей задаче F_ср = 153,6, следовательно,

С_оп = 0,48 · 153,6 = 73,3 г/л.

4. Вывод концентрация общего белка в сыворотке крови составляет 73,3 г/л, что соответствует норме.