Розділ 2 матеріали та методи досліджень

Об’єктом нашого дослідження стали (34+…) гербарних зразків дискоміцетів родини Helotiaсeae, які були зібрані під час дослідження мікобіоти Українських Карпат протягом 2014-2015 років, а також … зразків із зазначеної вище території, які були зібрані у 2010-2012 роках (Щербаковою Ю.В. та Джаган В.В.) та інсеровані до мікологічного гербарію кафедри ботаніки Київського національного університету імені Тараса Шевченка (KWU).

Пріоритет при проведенні польових робіт був відданий маршрутно-експедиційному методу. Це дозволило не тільки виявити таксономічний склад дискоміцетів, а й встановити приуроченість ряду видів до певних екотопів. Отже, було здійснено цілеспрямоване дослідження видового різноманіття дискоміцетів родини Helotiaсeae на території Українських Карпат, під час якого проведено ідентифікацію власних зборів (5 експедиційних виїздів в межах Закарпатської області), здійснених у період 2014-2015 рр., та зразків, що інсеровані до колекції мікологічного гербарію кафедри ботаніки Київського національного університету імені Тараса Шевченка (KWU), зібраних у період з 2010 по 2012 роки. Знахідки видів даної родини були зареєстровані на території Кевелівського лісництва Свидовецького та Чорногірського заповідних масивів Карпатського біосферного заповідника, Ясинянського лісомисливського господарства в долині р. Чорна Тиса (околиці с. Чорна Тиса) Рахівського району, в околицях м. Перечин, Перечинського р-ну Закарпатської області, а також на території Говерлянського л-ва Карпатського національного природного парку (Яремчанський р-н, Івано-Франківська область).

Зібраний матеріал фотографували (фотоапаратами Sony Cyber-shot DSC-H3 8.1 MP та Canon EOS Ti Rebel) і разом із субстратом вміщували у паперові пакети та коробочки, на яких вказувалось місце та дата збору зразка. Гербаризовані зразки перекладали у пластикові пакети.

Камеральна обробка зібраного матеріалу проводилась згідно загальноприйнятих методик мікологічних досліджень [Дудка 1987, Baral 1992]. Для ідентифікації видів використовували визначники, монографії та атласи українських і зарубіжних авторів [Beug 2014, Breitenbach 1984, Dennis 1978, Ellis 1988, Hansen 2000, Medardi 2006, …].

Для вивчення морфологічної структури та анатомічних особливостей використовували світловий мікроскоп Ulab XY-B2T та камеру Canon PC 1089 Power shot G6 відповідно.

Гербарні зразки спочатку підлягали процедурі регідратації за допомогою 3% розчину гідроксиду калію (3 г кристалічного KOH, розчиненого у 97 мл дистильованої води) [Ammirati 1985, Gupta 2013]. Важливо додавати КОН до зразку у малих кількостях, адже надмірна кількість може призвести до деформації структур зразка, в особливості спор [Gupta 2013].

Після регідратації мікроскопію проводили у воді, аби найточніше описати колір та форму мікроморфологічних структур [Yang 2007]. Для вимірів елементів мікроморфології було здійснено їх фотофіксацію на мікропрепаратах з водою та використано програму AxioVision Version 4.8 (Carl Zeiss Imaging Solutions, Німеччина). При описі розмірних характеристик відбирали близько 100 більш-менш зрілих спор. Інші мікроструктури (аски, парафізи, волоски та клітини ексципулу) у кількості – не менше 20 шт. При вивченні розмірних характеристик спор аналізувалися діапазон, співвідношення довжини до ширини (Q), та середнє значення (X) при n = 100 [Jeannerot 2013].

При встановленні амілоїдності апексів сумок використовували реактив Мельцера (MLZ). Для приготування реактиву беруть 1,5 г кристалічного йоду, 5 г йодиду калію і 100 мл хлоральгідрату на 100 мл води. Суміш нагрівають, не допускаючи закипання. Позитивна реакція може з’явитись як одразу, так і після 30 хв. В залежності від змін кольору зразка, виділяють 3 типи реакцій на фарбник: неамілоїдний тип реакції – зразок набуває жовтуватого забарвлення, що викликане кольором реактиву; амілоїдний тип – зразок набуває синього, синьо-сірого, чорного, фіолетового або чорно-фіолетового забарвлення; декстриноїдний тип – забарвлення зразку змінюється на коричневе, червонувате або фіолетово-коричневе [Ammirati 1985]. В свою чергу, амілоїдний тип реакції поділяють на два підтипи – еуамілоїдний (синього забарвлення без попередньої обробки гідроксидом калію) та геміамілоїдний (поява червоного забарвлення зразка при обробці розчином Люголя). Проте, якщо провести попередню обробку KOH, то в обох випадках буде спостерігатись зміна кольору зразка на синій [Gupta 2013]. Реактив вступає в реакцію з лугами, тому на одному зразку їх застосування небажане, через можливе спотворення результатів спостереження [Ammirati 1985].

Для дослідження морфології елементів плодових тіл, в тому числі волосків, різних типів клітин було використано 1% аміачний розчин Конго червоного (Congo Red) за Райтвіром. Для приготування до 99 мл води додають 1 г сухого барвника Congo Red, після чого відфільтровують надлишок. Амонійний розчин готують насиченням концентрованого гідроксиду амонію фарбником [Ammirati 1985]. Також для покращення якості мікрофотографій до розчину Конго червоного додавали розчин KOH [Vyzantiadis 2012, Abdo 2011].

Сучасні латинські назви виявлених видів подані відповідно до баз даних Міжнародної Мікологічної Асоціації, «MycoBank» [MycoBank], Міжнародного Мікологічного інституту CABI, «Index Fungorum» [Index of fungi], Catalogue of Life: 2016 Annual Checklist [Species 2014], а також узгоджено з останнім виданням «Ainsworth & Bisby’s Dictionary of the Fungi» [Ainsworth, 2008???].

Ступінь флористичної новизни ідентифікованих видів визначався відповідно до бази даних веб-сайту Грибів України [Fungi of Ukraine] та інших джерел, пов’язаних з поширенням іноперкулятних дискоміцетів на території України [Бублик 2016, Визначник 1969, Голубцова 2007, Іжик 2013, Зикова 2015, Морозова 2013, 2015, Сміцька 1975, Смицкая 1980, Щербакова 2012, 2015, 2015].