Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1 Объект исследования

Объектом исследования являлся бактериальный штамм Ochrobactrum, выделенный из накопительной культуры с полимерсодержащими материалами.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Изучение культуральных и морфологических признаков

штамма Ochrobactrum

Культуральные признаки колоний и характер роста по штриху отмечаем визуально. При этом обращаем внимание на профиль, край, поверхность, структуру, консистенцию и цвет колонии.

Культуральные признаки микроорганизмов на твердой среде изучали по следующим показателям:

- рост по штриху – сплошной с ровным краем, сплошной с волнистым краем, четковидный, диффузный, перистый, ризоидный;

- профиль колонии – плоская, выпуклая, кратерообразная;

- край колонии – гладкий, волнистый, зубчатый, лопастной, реснитчатый;

- поверхность колонии – гладкая, морщинистая, складчатая;

- оптические свойства колонии – прозрачная, просвечивающая, непрозрачная, блестящая, матовая;

- структура колоний – однородная, мелко- или крупнозернистая, радиально или концентрически исчерченная, врастающая в агар, легко снимающаяся иглой с агара;

- консистенция – маслянистая, тестообразная, сметанообразная, слизистая, сухая, плотная (Нетрусов, 2005).

Техника приготовления фиксированного препарата

Фиксация – такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются (Егоров, 1995).

Приготовление мазка

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю дистиллированной воды. Для обезжиривания стекол используют 96 %-й этиловый спирт. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно распределяют по центру предметного стекла. Остатки культуры на мазке сжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым и небольшим. Мазок фиксируют в пламени горелки, пронося над ее самой горячей частью 3 раза и оставляют высушивать на воздухе при комнатной температуре (Теппер, 2004).

Определение размера клеток

Измерения производили, пользуясь окулярным микрометром, значение которого было определено. Для этого сопоставили шкалу окулярного микрометра со шкалой объектного микрометра, линеечка которого равна 1 мм и разделена на 100 частей. Следовательно, одно деление объектного микрометра равно 0,01 мм, или 10 мкм. Объектный микрометр поместили на столик микроскопа и при тех же увеличениях, при которых производили измерения микробов, определили, сколько делений окулярного микрометра придется на одно деление объектного микрометра. По установлении значения деления в дальнейшем пользовались уже только окулярным микрометром, но всегда при одном и том же увеличении микроскопа (Нетрусов, 2005).

2.2.2 Цитологические особенности штамма Ochrobactrum

Цитологические признаки изучались с помощью приготовления фиксированных препаратов и различных типов окрашивания, в зависимости от того, какой компонент микробной клетки мы изучали.

Тинкториальные признаки бактерий характеризуют их способность вступать в реакцию с красителями и окрашиваться определенным образом.

Окраска клеточной стенки по Граму

1. На обезжиренном стекле сделать мазок микроорганизмов.

2. Препарат высушить на воздухе, зафиксировать над пламенем горелки.

3. Препарат окрашивать 30 сек раствором кристаллического фиолетового.

4. Краситель слить и не промывая мазок водой обработать его 30 сек раствором люголя.

5. Раствор люголя слить с поверхности мазка.

6. Препарат обесцветить в течение 15 сек 96 %-м этиловым спиртом, быстро промыть водой.

7. Дополнительно окрасить мазок водным фуксином в течение 1 мин.

8. Краситель слить, препарат промыть водой, высушить.

9. Препарат микроскопировать в иммерсионной системе (Сопрунова, 2006).

Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизма

Метод основан на разрушении грамотрицательных бактерий в щелочной среде

1. На обезжиренное предметное стекло наносим каплю 3 % раствора КОН.

2. Вносим в ту каплю петлю с исследуемой культурой и тщательно перемешиваем.

3. При тестировании грамотрицательных культур через 5-7 сек при движении петли вверх образуется слизистый след длиной 1-2 см; если след не образуется, то тестируемая культура грамположительная (Шадрина, 2007).

Определение кислотоустойчивости микроорганизмов –

окраска по Циль-Нильсену

1. Фиксированный на пламени горелки мазок накрыть фильтровальной бумагой.

2. Налить на нее карболовый раствор фуксина и подогреть; при появлении паров прекратить нагревание и оставить краску на препарате еще на несколько минут (2-3 мин).

3. Дав препарату остыть, удалить пинцетом бумажку и обмыть мазок водой.

4. Обесцветить препарат 5-10 %-м водным раствором H₂SO₄ в течение 3-5 мин (до желтоватого оттенка мазка).

5. Мазок тщательно промыть водой.

6. Сполоснуть мазок 96 %-м спиртом.

7. Снова промыть водой.

8. Докрасить мазок в течение 3-5 мин леффлеровской метиленовой синькой.

9. Краску смыть водой и препарат высушить.

10. Микроскопировать в иммерсионной системе (Нетрусов, 2005).

Окраска жгутиков по методу Леффлера в модификации Пешкова

1. Клетки осторожно взять петлей и перенести в пробирку с теплой стерильной водой.

2. Каплю суспензии просмотреть под микроскопом и убедиться в том, что клетки хорошо подвижны и плотность суспензии составляет 5-10 клеток в поле зрения.

3. Стекло 3-4 раза пронести через наиболее горячую часть пламени горелки.

4. Дать стеклу остыть.

5. Петлей нанести 3-4 капли суспензии на обожженную поверхность стекла.

6. Высушенный мазок залить на 15 мин протравой.

7. Протраву смыть дистиллированной водой.

8. Далее препарат окрашивать в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, погружая его мазком вниз в раствор красителя.

9. Препарат промыть водой, высушить на воздухе.

10. Микроскопировать в иммерсионной системе (Дикий, 2002).

Окраска жгутиков по методу Уварова

1. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в количестве 5 мл, осторожно погрузить петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми движениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешать, затем добавить в нее одну каплю формалина.

2. Нанести на чистое предметное стекло каплю эмульсии и подсушить препарат.

3. На высохший нефиксированный препарат налить раствор А, подогреть над пламенем, при слабом отхождении паров 1-2 мин.

4. Смыть препарат водой и слегка подсушить.

5. Затем на препарат налить раствор В, нагреть препарат 1-2 мин до слабых паров, обильно промыть и высушить.

Раствор А: смесь растворов «а» и «б» в пропорции 1:2.

Раствор «а» – насыщенный водный раствор калийных квасцов; раствор «б» – раствор сульфаниловой кислоты о,5 г + HCl 1,5 мл.

Раствор В: смесь растворов «в» и «г» в пропорции 3:1.

Раствор «в» – раствор Мюра: насыщенный водный раствор калийных квасцов KAl(SO₄)₂×12H₂O 25 мл + насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета 5 мл; раствор «г» – насыщенный спиртовой раствор основного фуксина (Шадрина, 2007).

Окраска нуклеоида бактерий

1. Из суточной культуры бактерий приготовить суспензию и нанести мазок на предметное стекло.

2. Мазок высушить на воздухе и зафиксировать смесью Никифорова в течение 2-3 мин.

3. Для фиксации мазка на дно чашки Петри нанести 2-3 капли фиксатора, а предметное стекло поместить на обрезки стекла мазком вниз.

4. Далее мазок подвергнуть гидролизу в 1 н. растворе HCl при t=60 ˚С 2-3 мин и немедленно тщательно промыть препарат водой.

5. Затем мазок залить 1 %-м раствором формалина на 1,5 мин и вновь промыть водой.

6. Мазок окрасить 1 %-м водным раствором основного фуксина 1-2 мин, промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать в иммерсионной системе (Шадрина, 2007).

Выявление гликогена и гранулезы в клетках бактерий

1. На обезжиренное предметное стекло нанести каплю микробной взвеси и добавить каплю раствора люголя.

2. Препарат накрыть покровным стеклом и микроскопировать в сухой системе (Шадрина, 2007).

Окраска волютина в клетках бактерий

Способ А:

1. Фиксированный мазок окрасить метиленовым синим 3-5 мин.

2. Промыть мазок водой, высушить.

3. Микроскопировать в иммерсионной системе (Сопрунова, 2006).

Способ Б:

Метод Омелянского

1. На обезжиренном предметном стекле приготовить тонкий мазок.

2. Мазок высушить на воздухе и зафиксировать над пламенем горелки.

3. На фиксированный мазок нанести карболовый фуксин Циля и окрашивать клетки 0,5-1мин.

4. Краску слить, препарат промыть водой и обесцветить 20-30 сек 1%-м раствором H₂SO₄.

5. Кислоту слить, препарат промыть водой и высушить.

6. Препарат микроскопировать в иммерсионной системе (Шадрина, 2007).

Окраска жировых включений бактерий

1. В каплю водной взвеси бактерий на предметное стекло добавить каплю раствора Судан III.

2. Материал накрыть покровным стеклом.

3. Микроскопировать в сухой системе (Шадрина, 2007).