1.2. Каталаза та глутатіон-s-трансфераза, як біомаркери функціонального стану здоров’я бджоли

Для оцінки загального стану здоров’я часто використовують ферменти різного роду в якості біомаркерів. Серед таких найпоширенішими є ацетилхолінестераза (КФ 3.1.1.7), карбоксилестераза (КФ 3.1.1.1), каталаза (САТ; КФ 1.11.1.6) і глутатіон-S-трансфераза (GST; КФ 2.5.1.18) [15].

В процесі аеробного метаболізму в клітинах бджіл, як і в інших живих організмах, при нормальних фізіологічних умовах в якості побічних продуктів безперервно формуються активні форми кисню (АФК): супероксид (О^• ), перекис водню (H₂O₂), гідроксильний радикал (HO^•-), перекис ліпідів (LOOH), гіпохлоритна кислота  (HOCl) та інші, які відіграють важливу роль у багатьох фізіологічних і біохімічних процесах: регуляції тонусу судин, клітинній проліферації, синтезі простагландинів, передачі сигналів від міжклітинних сигнальних молекул на регуляторні системи. Але АФК вимагають постійного моніторингу антиоксидантної системи (АОС) [13,31].

Процес утворення АФК активно використовується організмом комахи, як захисний механізм для нейтралізації ксенобіотиків та боротьбі з патогенами в процесах морфогенезу та регулювання тривалості життя [13].

Будь-яка стресова реакція організму в супроводжується короткочасним збільшенням кількості АФК, що викликає оксидативний стрес (ОС). [15,21] Це зумовлено адаптацією організму до екстремальних умов, за яких АФК також відіграють роль вторинних мессенджерів, беручи участь у сигнальній трансдукції та активації факторів транскрипції відповідних генів, зокрема тих, що кодують ферменти антиоксидантої системи [31,23].

ОС і молекулярні механізми антиоксидантного захисту у бджіл викликали особливий інтерес до дослідження цих комах, так як в остані роки масово відбувається втрати особин під час зимівлі і ослаблення бджолиних сімей [25,27]. ОС є постійною причиною або важливою складовою багатьох проблем для організму комах. В випадках коли швидкість утворення АФК переважає над швидкістю їх детоксикації відбувається пошкодження клітин. Однією з основних причин пошкодження і загибелі клітини внаслідок дії АФК на сьогодні вважається пероксидне окиснення ліпідів (ПОЛ) [32].

ПОЛ — це ланцюгова реакція, яка ініціюється гідроксил-радикалом, синглетним киснем і каталізується іонами перехідних металів.

Таким чином, ПОЛ починається з вибивання радикалом (гідроксил-радикалом, радикалом жирної кислоти або іншим радикалом) атома водню з метиленової групи ненасиченої жирної кислоти.

НЖК–Н + R^•- → НЖК^•- + RH

Утворений радикал жирної кислоти реагує з молекулою кисню, перетворюючись на пероксид-радикал.

НЖК^•- + О₂ → НЖК–ОО^•-

Пероксидний радикал може віднімати водень від іншої молекули жирної кислоти і відновлюватися до гідроперекису.

НЖК–ОО^•- + НЖК–Н → НЖК–ООН + НЖК^•-

Утворений радикал вступає в реакцію і виникає ланцюгова реакція, яка може продовжуватися уже без ініціюючих речовин. У поширенні ланцюгової реакції беруть участь іони феруму та інших перехідних металів.

Fe²⁺ + НЖК–ООН → Fe³⁺ + НЖК–О^•- + ОН^–

Fe³⁺ + НЖК–ООН → Fe²⁺ + НЖК–ОО^•- + Н⁺

Пероксиди ліпідів, які виникають, краще розчиняються у рідині, ніж поліненасичені жирні кислоти, тому легше вимиваються з мембран, що сприяє самооновленню мембранних структур [15;32]. Пероксиди жирних кислот нестабільні, в результаті розриву вуглець-вуглецевого зв’язку вони розпадаються з утворенням високотоксичних альдегідів 4-гідрокси-2-алкеналів, 4,5-епокси-2-алкеналів, які пошкоджують біомолекули клітини. На відміну від вільних радикалів, альдегіди є стабільними сполуками, здатними дифундувати на великі відстані [31].

Окиснення ненасичених жирних кислот спричиняє зміни співвідношення між насиченими та ненасиченими жирними кислотами, що призводить до підвищення проникності мембран для багатьох речовин та йонів. Як наслідок відбувається порушення властивостей гідрофобного бар’єру, зміни активності мембранозв’язаних ферментів [6,23]. Пероксиди ліпідів (ПЛ) руйнують сульфгідрильні сполуки, гормони, стероїди. Малоновий діальдегід (МДА) інгібує реплікацію ДНК та білковий синтез. У звязку з цим, важливе значення для клітини мають механізми детоксикації активованого кисню та репараціях пошкоджень залишків гліколіпідів [6].

Захист організму бджоли від деструктивної дії АФК забезпечується ферментами АОС шляхом прямої дії [26].

Супероксиддисмутаза (SOD) є першою лінією захисту організму проти вільних радикалів кисню [17]. Даний фермент перетворює радикал супероксид аніону (О^• ) на пероксид водню (Н₂О₂), який потім нейтралізує САТ [17,26].

О^• + О^• + 2Н⁺  1О₂ + Н₂О₂

2Н₂О₂  2Н₂О + О₂

САТ і є одним з провідних ферментів антиоксидантної системи, а також є найбільш вивчений серед класів ферментів. САТ є загальним ферментом, виявленим в майже всіх живих організмів [21;26]. Простота аналізу, залучення дешевого, легко доступного субстрату (Н₂О₂) і вражаючий показ виділення кисню зробили САТ привабливим об'єктом в якості біомаркера порушення метаболічних процесів [15].

Даний фермент є тетрамером, що відноситься до хромопротеїнів і мають в якості простетичної групи окислений гем. Одна молекула каталази може розкладати до мільйона молекул перекису водню в секунду. Специфічність каталази відносно субстрату-відновника невелика, тому каталаза може каталізувати не тільки розкладання Н₂О₂, але й окислення нижчих спиртів. Це дозволяє каталізувати окислення перекисом водню різних метаболітів і токсинів, у тому числі формальдегіду, мурашиної кислоти, фенолів, спиртів та ацетальдегідів Неконкурентними інгібіторами каталази є катіони важких металів, а конкурентними інгібіторами каталази є такі речовини, як цианіди а азиди [14,21].

GST є багатофункціональним ферментом, він виконує каталітичні реакції детоксикації широкого спектру токсичних з'єднань [15]. GST здатний інактивувати ксенобіотики та продукти ПОЛ шляхом кон'югації їх з відновленим глутатіоном і таким чином полегшуючи їх видалення з організму, також здатний блокувати стероїдні гормони, простагландини, білірубін та жовчні кислоти [15,22].

Рис. 1.2.1. Реакції за участю GST з: 1 — вільними радикалами жирних кислот; 2 — спиртами; 3 — дихлордифенілтрихлоретаном (інсектицид).

У медоносних бджіл найвища активність GST в основному спостерігається в середній кишці, так як при споживані їжі з нею потрапляє значна кількільсть шкідливих речовин, які детоксикуються даним ферментом, що призводить до зниження наслідків окисного стресу та ендогенної інтоксикації [15,26]. Також виявлено, що GST володіє пероксидазною активністю, тому він приймає участь не лише у репарації а і у профілактиці запобігання оксилювальних пошкоджень [22].

Інтерес до GST в основному орієнтується на їх роль в стійкості до інсектицидів різного походження. GST може блокувати деякі інсектициди шляхом полегшеного їх відновлення дегідрохлоруванням або шляхом реакцій кон'югації з відновленим глутатіоном, що дозволяє отримати водорозчинні метаболіти, які легше виводяться з організму [15,22].

Все вище зазначене дозволило використовувати показники активності САТ та GST в якості біомаркерів щодо впливу різноманітних абіотичних та біотичних факторів на стан антиоксидантної системи бджоли [15].