Прогностическое значение иммуногистохимического выявления онкопротеинов р53, р21,р27 и KiS1 в олигодендроглиомах больших полушарий головного мозга. Ю.Л. Яковлев, а.Г. Коршунов.

Олигодендроглиомы это – инфильтративно-растущие нейроэктодермальные опухоли, происходящие из клеток олигодендроглии, которые встречаются намного реже, чем астроцитомы, составляя 4-5% первичных опухолей головного и спинного мозга и 10-15% от всех первичных глиальных опухолей.

Влияние различных клинических и морфологических факторов на тактику комбинированного лечения олигодендроглиом (ОДГ) в настоящее время широко исследуется и применяется на практике. Однако остаётся недостаточно изученным влияние иммуноморфологических факторов на комплексное дифференцированное лечение ОДГ и их прогностическая значимость, хотя они являются ведущими в определении степени злокачественности опухоли, что делает актуальным нашу работу.

Для идентификации степени злокачественности ОГ применяются различные иммуногистохимические критерии. Наиболее распространённым в последние годы является метод определения пролиферативного потенциала клетки с помощью идентификации белка KiS1. ДНК топоизомераза II-альфа или KiS1 – это белок, представляющий собой фермент, участвует в сегрегации хромосом и выявляется в клетках путем устойчивой обработки ферментами и фиксации формалином. Этот белок является мишенью для химиотерапевтических препаратов таких как этопозид, тенидазид и доксарубин. Кроме того, этот энзим является индикатором клеточной пролиферации. Определяя процент опухолевых клеток, находящихся в фазе деления, высокое содержание антител специфических к ДНК топоизомеразе II-альфа, можно судить о повышенной пролиферативной активности и следовательно о степени злокачественности олигодендроглиом (Lynch B.J., Guinee D.G., et al.1997). Поскольку ДНК топоизомераза II-альфа, являющаяся маркером клеточной пролиферации в опухоли, выявляется в клетках в фазах S, G2, и М, т.е. маркирует наиболее значимые фазы митотического клеточного цикла, то выделение этого фермента важно для определения сроков выживаемости и прогнозирования чувствительности к химиотерапевтическим препаратам (Holden J.A., Townsend J.J., 1999).

Экспрессия Р53. Ген р53 локализуется на коротком плече 17 хромосомы. Этот ген ответственен за синтез фосфопротеина с молекулярной массой 53 кД, последний обнаруживается во всех тканях человеческого организма. Мутации гена р53 обнаруживаются достаточно часто в астроцитомах (20-57%) (Vecht C., et al., 1990; Kyristis P., et al.,1996). Мутации гена р53 встречаются как в доброкачественных, так и в злокачественных астроцитарных глиомах, следовательно, этот ген может инактивироваться на различных стадиях опухолевой прогрессии астроцитарной глии. Результаты исследований, посвященных анализу прогностической значимости онкобелка р53 для больных с олигодендроглиомами, свидельствуют о ее незначительном влиянии на сроки выживания (Hagel C., et al., 1999).

Белки р27 и р21 являются универсальными ингибиторами клеточного цикла. Белок р27 ингибирует циклиновые комплексы с помощью циклин зависимой киназы, предотвращая переход клеточного цикла в фазу Gl. Во многих исследованиях выявлено, что при увеличении экспрессии р27 уменьшается пролиферативная активность различных опухолей. Мутация р27, которая встречается редко, приводит к понижению уровня р27 и, вследствие этого, к малигнизации опухолевой клетки. В астроцитомах и олигодендроглиомах по данным Schiffer и др., 1999, была выявлена корреляция р27 со степенью злокачественности опухоли и выживаемостью пациентов.

В современных исследованиях было показано, что экспрессия белка р27 связана со способностью олигоденроцитов дифференцироваться и выходить из митотического цикла. То есть экспрессия этого белка является своеобразным индикатором степени дифференцировки олигодендроцитов человека и животных, в частности их эмбриологических свойств. Таким образом, можно предположить, что среди групп с доброкачественными ОДГ и низкими показателями экспрессии белка р27 их потенциал дифференцировки несколько ниже. Эти опухоли, являясь доброкачественными светооптически, на иммуногистохимическом уровне являются низко дифференцированными. Необходимо также подчеркнуть, что экспрессия белка Р27 является более значимым фактором для безрецидивного течения доброкачественных олигодендроглиом, чем число делящихся клеток, определяемым методом детекции белка КiS1.

Протеин р21 непосредственно связан с cdc2 (cdk1), cdk2 и cdk4 и может действовать как универсальный ингибитор ферментной активности. Комплекс, содержащий р21 и cyclin-cd’k также снижает АЯПК (PCNA), и р21 является маркером, указывающим на блокирование АЯПК активизации ДНК -полимеразы (Flores-Rozas H., Kelman Z.,1994; Waga S., et al., 1994).

По данным ряда авторов экспрессия онкобелка р21 ингибирует апоптоз и увеличивает сроки выживания опухолевых клеток (Gomez M. et al., 1997; McDermott M.,et al. 1998).В то же время в последние годы появились публикации, показывающие влияние белка р21 на программируемую гибель клеток.

Таким образом, в ряде исследований проводилось определение возможной взаимосвязи между иммуноморфологическими характеристиками опухолей и степенью их злокачественности. Однако целенаправленного изучения прогностической значимости иммуногистохимических критериев и зависимость от них комбинированного лечения ОДГ до настоящего времени не проводилось.

Основной целью настоящего исследования было определение возможной взаимосвязи между сроками общей (ОВ) и безрецидивной выживаемостью (БРВ)– изучение эффективности дифференцированного комбинированного лечения ОДГ (хирургического, лучевой терапии и химиотерапии) в зависимости от показателей маркёров онкобелков.

Материалы и методы.

Проведен анализ данных катамнеза 82 больных, из них 35 мужчин и 47 женщин в возрасте от 17 до 61 года.

На основе морфологических критериев больные были разделены на 2 группы: в 37 случаях опухоли были отнесены к анапластическим олигодендроглиомам (АОДГ) и в 45 случаях к доброкачественным олигодендроглиомам (ОДГ), на основе морфологических критериев.

Тотальное удаление опухоли было произведено у 22 больных, субтотальное - у 53 человек, частичное – у 7 пациентов. Из них стереотаксическая биопсия была проведена у 15 больных. В послеоперационном периоде лучевую терапию получили 67 больных, из них 34 с ОДГ и 33 с АОДГ; полный курс химиотерапии получили 15 пациентов, из них четверо с АОДГ. Сведения о судьбе больных были получены не ранее, чем через 24 месяца после операции.

Во всех случаях было проведено исследование биоптатов опухоли с определением экспрессии онкобелков: р53, p27, p21, KiS1, с определением влияния этих белков на общую выживаемость (ОВ) и безрецидивную выживаемость (БРВ) с помощью составления кривых выживания по функции Каплан – Мейера и теста log-rank.

Результаты и обсуждение.

В результате сопоставления иммуногистохимических и катамнестических данных были обнаружены следующие закономерности.

Важным показателем, который оказал влияние на продолжительность жизни у больных с олигодендроглиомами, является белок р27 (Кip1) – это ингибитор, циклин-зависимая киназа, который предотвращает вступление клетки в митотический цикл, охраняя точку рестрикции митотического цикла. Экспрессия этого белка также показала существенное значение для безрецидивной выживаемости, поскольку уменьшение этого белка ниже уровня 20% в опухоли является прогностически неблагоприятным фактором в группе доброкачественных олигодендроглиом, где экспрессия этого белка коррелировала с безрецидивной выживаемостью.

Во всех опухолях ИМ р27 вариьировал от 10% до 70%. Среднее значение – 36%. В доброкачественных олигодендроглиомах средний ИМ р27 был выше и составлял 42%. В анапластических олигодендроглиомах -32%.

Выявлена положительная корреляция р27 (р<0,05) с ОВ и БРВ для всей группы пациентов и для группы с ОДГ. В общей группе, где выявлялась экспрессия р27, ОВ составила 39,8 месяца по сравнению с другой группой, где экспрессия не отмечалась (ОВ=26,1 месяца). Кроме того, БРВ для части больных с экспрессией Р27 составила 29,7 месяца, в остальной группе – 18,6 месяца.

Р ис. 1. Влияние экспрессии р27 на общую выживаемость больных с олигодендроглиомами (вся группа).

1. отсутствие экспрессии р27 2. наличие экспрессии р27

Рис. 2. Влияние экспрессии р27 на безрецидивную выживаемость больных с доброкачественными олигодендроглиомами.

1 . отсутствие экспрессии р27. 2. наличие экспрессии р27.

При иммуногистохимическом выявлении онкобелка КiS1 в астроцитарных глиомах обнаружена четкая взаимосвязь между индексом мечения КiS1, наличием митотических клеток и степенью злокачественности опухолей, а так же прогнозом жизни больных.

При анализе экспрессии ОВ и БРВ в общей группе выявлено, что наличие экспрессии KiS1 более 10% в опухолевых клетках значительно укорачивало сроки ОВ и составляло 32,5 месяца, в то время как в группе больных, где экспрессия KiS1 была менее 10% - эта цифра равнялась 37 месяцам (р<0,05).

Особенно это выявлялось в группе злокачественных опухолей. Таким образом, белок КiS1 может быть рекомендован для использования в клинической практике, для определения прогноза, а также идентификации опухолей высокой степени злокачественности.

Р исунок. 3 Влияние иммуноэкспрессии KiS1 на общую выживаемость в олигодендроглиомах.

В нашем исследовании статистический анализ общей и безрецидивной выживаемости не выявил корреляции с экспрессией онкобелка р53. Log-rank тест р=0,25 для общей выживаемости (разница не достоверна), и для безрецидивной выживаемости р=0,9 (разница не достоверна).

При изучении ммуногистохимических препаратов выраженность ядерной экспрессии р21 с окрашиванием 4-6% клеток была выявлена в 20 олигодендроглиомах. Существенного различия в выявлении р21-позитивных клеток среди доброкачественных и злокачественных опухолей не установлено: 12 (9%) среди доброкачественных и 8 (5%) среди злокачественных. Статистический анализ общей и безрецидивной выживаемости в общей группе и подгруппах с ОДГ и АОДГ не выявил корреляции с экспрессией белка р21..

Проведенное исследование позволило разделить группу больных на 4 класса. Группа больных с доброкачественными олигодендроглиомами подразделяется на группу больных с высоким и низким уровнем р27. У них различается безрецидивная выживаемость, число рецидивов и общая выживаемость. В группе злокачественных олигодендроглиом опухоли можно разделить на 2 категории в зависимости от высокого уровня экспрессии онкобелка KiSı больше 10%. На основании выделенных нами категорий возможно проведение дифференцированной лечебной тактики в группе этих больных.

Больные с доброкачественными олигодендроглиомами и высокими показателями белка р27 в опухоли в случае тотального удаления опухоли могут быть оставлены под наблюдением без дальнейшего назначения лучевой терапии и химиотерапии. Больные с доброкачественными олигодендроглиомами с наличием низкого р27, с риском возникновения рецидива и возникновения анапластической трансформации опухоли в случае любой степени радикальности проведёного оперативного вмешательства показана лучевая и химиотерапия.

Злокачественные олигодендроглиомы разделились на группы в зависимости от экспрессии белка КiSı. Здесь на наш взгляд тактика должна быть следующей: в опухоли с низкими показателями КiSı т.е., меньше 10% показана традиционная используемая при ОДГ схема - лучевой и химиотерапии в режиме РСВ. При наличии в опухоли высокой экспрессии онкобелка КiSı т.е. при пролиферативном потенциале более 10% по этому маркеру возможно в случае успешного лечения методами традиционного лечения используют препараты, которые являются мишенями для онкобелка КiSı – доксарубицин и др., которые пока не нашли широкого применения при олигодендроглиомах.

Перспективным является также изучение генетических мутаций, которые определяют чувствительность олигодендроглиом к химиотерапии и вообще всех явлений, которые в той или иной степени связаны с химиотерапевтической чувствительностью олигодендроглиом. Так в исследованиях последних лет доказано, что опухоли с повреждением 1 хромосомы с её делецией являются наиболее чувствительными к химиотерапии в режиме РСV. Перспективным является либо изучение непосредственно структуры ДНК с помощью полимеразно-цепной реакции, либо исследование гена - супрессора р18, который находится на первой хромосоме с помощью иммуногистохимических методик, т.е., использование этого метода можно считать перспективным для выделения группы ОДГ, являющихся химиочувствительными.

Также необходимо проведение исследований в перспективе для выявления химиорезистентных протеинов, которые собственно определяют чувствительность опухоли к воздействию различных химиопрепаратам, к ним относятся металлотионины, глютатионтрансфераза, р–гликопротеин, и ряд других субстанций которые тоже могут оказывать влияние на разрушение лекарственных препаратов в опухолевых клетках. Таких работ на настоящий момент в литературе не представлено.

Заключение.

Таким образом, можно заключить, что проведенное исследование позволило выявить несколько разновидностей ОДГ, которые распределяются в 2-х основных субкатегориях – злокачественные и доброкачественные опухоли. Среди этих факторов, степень злокачественности является, несомненно, наиболее значимым для определения тактики лечения. Однако наличие тех или иных иммунногистохимических вариаций может предположить какой-то дифференцированный лечебный подход в этих группах олигодендроглиом.