Бактериологическое исследование
Первичную бактериоскопию можно использовать только при исследовании пунктатов лимфоузлов или органов от трупа. Мазки-отпечатки лучше окрашивать по Граму и Романовскому-Гимзе. Этот метод самостоятельного диагностического значения не имеет и является вспомогательным. Он ориентирует бактериолога на выбор питательных сред. Посевы исследуемых материалов делают на среду Эндо и Серова (100 мл 1% ПВ, 1 мл индикатора фенолрот, 0,75 г глюкозы, рН 7,4-7,6) инкубируют при 37 ° С 48-72 час. Посевы на среду Серова выдерживают 15-20 суток в холодильнике с последующим посевом на дифференциальные среды. Подозрительные колонии мелкие, круглые, выпуклые, бесцветные исследуют микроскопически и пересевают на среду Олькеницького. Колонии Y. pseudotuberculosis в R-форме почти такие же, как у возбудителя чумы, но в своем развитии не имеют стадии "битого стекла". Идентифицируют культуры по обычной схеме (посев на среду Гисса, фаголизис, определения серотипов с помощью диагностических аглютину действующих сывороток). Дифференциацию с другими иерсинии проводят по дополнительным тестам.
Серологическая диагностика
Для серологической диагностики псевдотуберкулеза ставят развернутую объемную реакцию агглютинации (подобно реакции Видаля) с соответствующими диагностикумами. Антитела в крови больных накапливаются на второй неделе болезни. Диагностический титр 1:200 и выше. Еще лучшие результаты дает постановка РНГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом. Положительной эту реакцию считают при титре антител 1:400 и выше. Разработана также схема постановки реакции ензиммичених антител с использованием полистирилових планшет с адсорбированным на твердой фазе антигеном.
Биологическа проба
Биологическую пробу лучше проводить на гвинейских свинках, так иерсинии, выделенные от человека, мало патогенные для мышей. Зараженные свинки погибают через 4-12 дней. У животных исследуют мазки - отпечатки из органов и делают посевы на питательные среды с последующей идентификацией выделенных культур.
Аллергическая проба
Аллергическую пробу ставят, начиная со второй недели заболевания. Состояние сенсибилизации развивается с 7-20-го дня и сохраняется в течение 2-5 лет. Аллерген вводят внутрикожно в объеме 0,1 мл. Учет реакции проводят через 48 часов. При положительной пробе возникает покраснение и инфильтрат, которые порой чешутся и болезненны.
27. Микробиологическая диагностика кишечного иерсиниоза.
(1) основной - бактериологический, посев на среды Эндо, Левина при 25-28о С,
(2) экспрессный - ИФА,
(3) серологический - РА и РНГА (на парных сыворотках).
Материалом для исследования служат испражнения, моча,кровь, спинномозговая жидкость.
С целью выделения антигенов возбудителя, что обеспечивает раннюю диагностику иерсиниоза, используют метод флюоресцирующий антитела, реакцию торможения непрямой гемагглютинации (РГНГА), реакцию коаглютинации и реакцию агглютинации латекса.
РГНГА по чувствительности близка к ИФА, превосходит по этому показателю РСК и вероятно по воссозданию результатов. Считают, что диагностическим является разведение сыворотки крови 1: 200, но диагностическая ценность метода возрастает при увеличении титра в динамике. Диагностическая ценность метода приближается к 100%.
Для реакции агглютинации используют живые культуры или формализацию препаратов как антигенов, реакция становится положительной с 10-14-х суток болезни. Возможны неспецифические результаты исследования.
Внедрение ИФА позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью распознавать иерсиниоз. Специфичность теста составляет 95%, чувствительность — 82%. Наиболее информативными современными методами являются ПЦР и иммуноблоттинг, однако их воспроизводимость возможна только в специализированных лабораториях.
28. Морфобиологические св-ва возбудителей кампилобактериоза и хеликобактериоза. Микробиологическая диагностика заболеваний.
Род Campylobacter (Campyla - изогнутые) относится к группе аэробных или микроаэрофильных подвижных спирально изогнутых грамотрицательных бактерий. Наибольшее значение в патологии человека имеет С. jejunii. Реже встречаются С. fetus и С. coli. Ранее отнесенный к данному роду С. pylori выделен в род Helicobacter.
Тонкие вибриоидные клетки, имеющие один или более витков спирали. Споры не образуют. Подвижные, совершают характерное винтовое движение с помощью одиночных жгутиков, расположенных на одном или обоих частях клетки. Хемоорганотрофы не требовательны к питательному субстрату, не сбраживают углеводы. Для получения энергии используют аминокислоты, а не углеводы. Оксидазоположительные и уреазоотрицательные. Пигментов не образуют.
Кампилобактеры содержат О-, К- и Н-антигены. В настоящее время выделено свыше 50 О-серогрупп кампилобактеров.
К факторам вирулентности относят жгутики и муциназу, способствующие проникновению в слизистую оболочку тонкой кишки. Обладают умеренной пенетрационной активностью. Их токсичность связана с секрецией энтеротоксинов (функциональные блокаторы), нарушающими водно-солевой обмен через образование цАМФ, аналогично энтеротоксинам Е. coli и V. cholerae. При разрушении кампилобактеров освобождается эндотоксин. Описаны цитотоксины, вызывающие гибель чувствительных клеток. После колонизации участка тонкой кишки они могут проникнуть в кровяное русло, вызывая генерализованную инфекцию, чаще у иммунодефицитных лиц. В патогенезе кампилобактериозных энтеритов преобладают явления диареи или дизентериеподобных состояний. При этом С. jejunii и С. fetus вызывают энтериты у людей. С. jejunii встречается также при абортах овец. С.fetus чаще встречается у пожилых людей с иммунодефицитами, а также при некишечных формах кампилобактериоза, вызывая поражение паренхиматозных органов и даже сепсис.
При кампилобактериозе наблюдается гуморальный иммунный ответ. Однако образующиеся антитела не обладают выраженными протективными свойствами.
Источником инфекции являются больные животные и люди, от которых кампилобактеры попадают в пищевые продукты (мясо, молоко) и воду. Передача инфекции происходит алиментарным путем. Возможен и контактно-бытовой путь. В окружающей среде при 4°-10°С сохраняются около недели. Зарегистрированы пищевые, молочные и водные вспышки кампи-лобактериоза, чаще у детей.
Род Helicobacter
H.pylori представляют собой мелкие грамотрицательные палочки, лофотрихи, микроаэрофилы. Растут на сложных питательных средах. Продуцируют каталазу и оксидазу, которые используют для идентификации этих бактерий.
К факторам вирулентности хеликобактеров относят их способность к движению и участие в проникновении в слизистую оболочку. Фермент уреаза при разрушении мочевины до аммиака и СO2 приводит к образованию газовой оболочки, защищающей от кишечного сока. Хеликобактеры продуцируют фосфолипазы, разрушающие фосфолипиды. Их токсичность связана с цитотоксином, действующим на эпителиальные клетки, токсином, нарушающим межклеточные контакты, и с ЛПС. Кроме того, на поверхности клеток образуются белки теплового шока, которые рассматривают как реакцию на стресс. Это приводит к аутоиммунному воспалению и образованию язв в желудке и двенадцатиперстной кишке. Н. pylori выделяются в 80% случаев язвенных гастритов.
Является представителем нормальной микрофлоры животных. Пути передачи человеку окончательно не выяснены. По-видимому, люди заражаются алиментарным путем.
Инфекционные заболевания, которые вызывают бактерии рода Campylobacter, получили общее название кампилобактериозы. Они имеют острое течение, сопровождающиеся лихорадкой, поражением желудка и кишечника и с каждым годом встречаются все чаще. Среди 13 видов кампилобактерий главнейшими являются: Campylobacter jejuni, C.coli.
В 1991 p. выделен отдельный вид Helicobacter pylori. Его стабильно обнаруживают у больных язвой желудка, гастрит и дуоденит. Этим заболеванием дали общее название геликобактериоза. Кроме энтеритов и энтероколитов, этих частых кампилобактериоз, значительно реже встречаются септицемии, эндокардиты, перикардиты, менингиты, поражения мочеполовой системы. У беременных женщин возможны аборты, преждевременные роды, инфицирование новорожденных во время родов. В связи с тем, что клиническая картина этих заболеваний не имеет характерных симптомов и подобная вызванных другими бактериями, лабораторные исследования приобретают важное значение.
Для диагностики широко используют микроскопический, бактериологический и несколько меньше серологический методы. Материалом для исследования служит кровь, ликвор, стул или содержимое прямой кишки, взятый с помощью ректальных тампонов, плацентарная и околоплодной жидкости, содержимое абсцессов, биоптаты слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки. Исследуют также воду, молоко, другие продукты питания, смывы с предметов и т.п..
Бактериоскопический метод используется для быстрой идентификации кампило-и геликобактерий. Тонкие мазки из фекалий и других клинических материалов фиксируют на огне, окрашивают фуксином Пфейфера течение 10-20 с и промывают водой. Поскольку для окраски других бактерий требуется 3-5 мин, то в течение 10-20 сек успевают зафарбуватись только кампилобактерии. Особенно четко их типовые формы обнаруживают при окраске кристаллическим фиолетовым. Под обычным световым микроскопом они выглядят как тонкие, спирально изогнутые бактерии, имеющие один полный завиток, С-и S-образную форму или напоминают крылья чайки. Helicobacter pylori имеет несколько большие размеры. Можно также использовать фазово-контрастную микроскопию суспензии стула в бульоне для культивирования бруцелл или жидкой среде Мюллера-Хинтон (МПБ с крахмалом и казеином). При этом выявляют не только типичные особенности морфологии кампилобактерий, но и очень характерную их подвижность.