1.3. Риа, характеристика метода, варианты, применение.

Применяется для определения концентрации гормонов, лекарственных препаратов, серодиагностики, идентификации инфекционных заболеваний. Метод высокочувствительный и позволяет обнаружить незначительное количество реагента (10 – 12 г\л). Наиболее часто применяется для определения сывороточных белков, гормонов, метаболитов, для серодиагностики и сероидентификации.

Основан на специфическом взаимодействии антител и антигенов, одни из которых мечены радиоактивными изотопами, например, J 135. Выявляет изменения рецепторов после взаимодействия антигенов и антител.

Был предложен в 1960 году для определения концентрации инсулина в плазме крови, потом нашел широкое применение в иммунологических исследованиях.

Результаты оценивают по изменению радиоактивности, которую измеряют с помощью радиоактивных счетчиков.

На сегодняшний день существует много вариантов постановки реакции.

Различают:

1. С использованием растворимой (жидкой) фазы – основан на принципе конкурентного торможения, т. е. связывания меченного радиоактивным веществом антигена специфическими антителами. Зависит от концентрации немеченного антигена.

+ * J₁

+ * * * J₂ = J₁ – J₂

+ J_х

Чем больше связывание немеченных антигенов, тем меньше R комплекса: Аг-Ат.

Осаждение комплекса осуществляют 50% раствора аммония сульфата (метод Фарра) либо путем преципитации его с соответствующей антисывороткой (метод двойных антител).

2) При использовании твердой фазы один из компонентов реакции фиксируют на твердой основе, что позволяет легко отделить комплекс антиген-антитело от свободного компонента реакции.

Наиболее часто применяется классический конкурентный вариант и прямой вариант.

Конкурентный РИА (сероидентификация):

Основан на конкуренции стандартного радиоактивного антигена и немеченого искомого антигена за активные участки антител.

*Компоненты:

1. Специфическая иммунная сыворотка.

2. Стандартный диагностикум (антиген), меченый изотопом.

3. Исследуемый материал, содержащий неизвестный антиген.

*Методика постановки: ставится в 2 этапа.

1 этап:

А Г*J 135 + АТ АГ*J 135 АТ

меченый специфическая комплекс выпадает в

стандартный иммунная осадок, радиоактивность

диагностикум сыворотка которого измеряется в R1

2 этап:

А Г + АТ + АГ*J 135 АГ АТ + АГ*J 135 АТ

исследуемый специфич. меченый комплекс комп

вариант иммунная стандартный № 1 лекс №2

сыворотка диагностикум выпадают в осадок,

радиоактивность

которого измеряется

R2

+ АГ*J 135

свободный

несвязывающийся

отмывается

R1 + R2 – радиоактивности комплексов (осадка), которая определяется количественно при помощи радиоактивных счетчиков.

Если R1 > R2 – указывает на наличие в исследуемом материале искомого антигена.

R1 – R2 – точное количество искомого антигена.

Конкурентный РИА применяется в основном, для сероидентификации неизвестных антигенов в исследуемом материале.

Прямой РИА (серодиагностика):

*Компоненты:

1. Стандартный диагностикум, меченый изотопом.

2. Исследуемая неизвестная сыворотка.

* Методика постановки:

А Г*J 135 + АТ АГ*J 135 АТ + АГ*J 135

радиоактивный исследуемая комплекс надосадочная

стандартный сыворотка выпадает в осадок жидкость с

диагностикум радиоактив- С известной ностью

радиоактивностью R2 R1

Если R1 > R2- указывает на наличие в исследуемой сыворотке искомых антител.

R1-R2 – точное количество искомых антител.

Прямой РИА используется, основном, для серодиагностики.

* Преимущества РИА и его применение:

1. высокая чувстельность и специфичность (позволяет определить белок в следовых концентрациях ≈ 10 * ‾ 12 г/л);

2. быстрота проведения анализа;

3. возможность количественного определения.

* Недостатки:

1. изотопные метки быстро разрушаются;

2. требует сложного специального оборудования и специальных условий, т. к. работа с изотопами опасна и требует соблюдения строгих правил.

В последнее время широко применяется твердофазный РИА, при котором один из компонентов фиксируется на твердой фазе: на пластинах из полимера полиэтилена, полипропилена, полистирола.

Радиоиммунный сорбентный тест применяется для определения Ig E. Анти- Ig E- , фиксирование на нерастворимых частицах (например сефадекса), инкубация с меченным Ig E и сывороткой больного. Чем выше содержание Ig E в сыворотке крови, тем меньше количество связанного меченного Ig E.