Литература

1. Валетов, В. В. Физиологические аспекты кормления сельскохозяйственных животных: монография / Валетов В. В., Дегтярева Е. И. – Мозырь: УО МГПУ имени И.П. Шамякина. – 2013. – 88 с.

2. Сарасеко, Е. Г. Влияние особенностей торфяных почв республики Беларусь на качественный состав грубых кормов / Е. Г. Сарасеко, Е. И. Дегтярева // Современные экологические проблемы устойчивого развития Полесского региона и сопредельных территорий: наука, образование, культура: материалы V Междунар. науч.-практ. конф. Мозырь, 25–26 октября 2012. / УО МГПУ им. И.П. Шамякина; редкол.: О. П.Позывайло (отв. ред.) и др.. – Мозырь, 2012.  С. 272–275.

3. Гольдберг, Е. Д. Гематологические показатели у работников рентгенологических и радиологических отделений / Е. Д. Гольдберг, О. С. Голосов, К. Г. Потехин / Мед. вестник. – 1981.  № 5. – С. 49–54.

4. Акоев, И. Г. Отдаленные последствия облучения в системе крови / И. Г. Акоев // Мед. радиол. – 1998. – № 1. – С. 21–27.

ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ КУТИКУЛЫ МАДАГАСКАРСКОГО ШИПЯЩЕГО ТАРАКАНА (GROMPHADORINA GRANDIDIERI)

А. А. ВЕТОШКИН, Т. В БУТКЕВИЧ

Белорусский государственный университет, г. Минск,

email: aleksey.vetoshkin@mail.ru

Введение. Структура макромолекул хитина и хитозана обусловливает проявление антиоксидантных, радиопротекторных, иммуномодулирующих, волокно- и пленкообразующих свойств. А низкая токсичность и способность данных биополимеров к биодеградации раскрывают широкие перспективы к их использованию в медицине, пищевой промышленности, фармакологии, микробиологии, сельском хозяйстве и косметической промышленности [1]. Расширение областей применения данных полисахаридов обусловливает поиск их новых перспективных источников.

Одним из таких потенциальных источников природных полисахаридов является кутикула насекомых. Как известно, покровы насекомых содержат до 50% хитина, который, наряду с белками, придает прочность экзоскелету [2]. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ с возможностью выделения их в отдельном виде или в виде комплексов. Учитывая, что практический выход хитина обычно составляет не более 5% от общей начальной массы сырьевого источника, нужен легко возобновляемый ресурс получения этих биополимеров. К таким источникам можно отнести мадагаскарского шипящего таракана (Gromphadorina grandidieri). Из этого представителя зоокультуры можно получить значительное количество сырья, пригодного для получения хитина и хитозана. Заготовка сырья не представляет трудности, так как при сбалансированном рационе питания, температурном режиме, относительной влажности воздуха, освещенности и оптимальной плотности насекомых в садках с учетом сезонных изменений в структуре популяции возможно легко сохранить и в приемлемые сроки размножить культуру этих насекомых. Таким образом, актуальным является разработка ресурсосберегающих технологических основ получения биологически активных соединений из этого сырья.

Цель работы – разработка технологии комплексной переработки зоокультуры мадагаскарского шипящего таракана (Gromphadorina grandidieri) для получения биологически активных соединений: хитина и хитозана.

Материалы и методика исследований. Объектом исследования являлось имаго мадагаскарского шипящего таракана (Gromphadorina grandidieri).

Технологическая схема комплексной переработки объекта исследования включала следующие стадии:

На стадии подготовки сырья образцы мадагаскарских тараканов измельчали и проводили водную экстракцию из 10% суспензии при температуре 80°С в течение 1 ч, тем самым удаляли водорастворимый меланин. Фильтрацией отделяли меланиновую фракцию, а твердый остаток замораживали, лиофильно высушивали и использовали для переработки.

Хитин-меланиновый комплекс (ХМК) получали в результате депротонирования твердого осадка 10%-ным раствором NaOH при температуре 45–55°С в течение 2 ч, и отделения его фильтрацией с последующей промывкой дистиллированной водой до рН промывных вод 7,0 и лиофильной сушкой.

Стадия обесцвечивания ХМК осуществляли 3%-ным раствором Н₂О₂ при температуре 45–55°С в течение 4 ч. После фильтрации реакционной смеси, твердый остаток – хитин – промывали дистиллированной водой до рН 7,0, высушивали и использовали далее для получения хитозана.

Деацетилирование хитина проводили 50%-ным раствором NaOH при температуре 125–130°С в течение 1,5 ч. По окончании процесса суспензию охлаждали до 50°С и фильтровали для получения твердого остатка, который тщательно промывался до нейтральных промывных вод. Полученный продукт – высокомолекулярный хитозан.

Результаты исследований и их обсуждение. Мадагаскарский таракан (Gromphadorina grandidieri) может рассматриваться в качестве возобновляемого источника хитина и его производных. В составе его кутикулы содержится до 35 % хитина [2]. Также особенностью этого сырьевого источника является низкое содержание в кутикуле минеральных веществ (до 4%) и присутствие меланинов. Поэтому, в отличие от технологии переработки основного источника хитина и хитозана (ракообразных), при использовании сырья из исследуемого объекта можно убрать из технологической схемы стадию деминерализации. Предложенная технология комплексной переработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических способов обработки.

В результате переработки из зоокультуры мадагаскарского таракана (Gromphadorina grandidieri) получены биологически активные соединения: хитин-меланиновый комплекс, хитин и хитозан. Выход продуктов технологии переработки представлен в таблице.

Таблица – Характеристика продуктов переработки подмора пчел

Стадия	Продукты	Выход, %
Депротеинирование	Хитин-меланиновый комплекс	27,05
Обесцвечивание	Хитин	93,75
Деацетилирование	Высокомолекулярный хитозан	72,5

Наибольшие потери происходят на стадиях депротеинирования и деацетилирования. Практический выход хитозана составил около 5% от общей начальной массы сырьевого источника, что показывает возможность успешного применения зоокультуры мадагаскарского шипящего таракана (Gromphadorina grandidieri) в качестве источника для выделения хитина и последующего получения из него хитозана. При переработке зоокультуры мадагаскарского таракана по разработанной технологии удалось полностью избавиться от пигмента и на выходе получить чистый хитин и хитозан, в отличие от работ, где из других представителей членистоногих получили хитозан-меланиновый комплекс [3]. Что также является плюсом выбранного сырья и технологии его переработки.

Заключение. Зоокультура мадагаскарского шипящего таракана (Gromphadorina grandidieri) является перспективным источником для выделения биологически активных соединений.

Предложенная технология комплексной переработки позволяет получить: хитин-меланиновый комплекс, хитин и хитозан, различающиеся по структуре и свойствам, что расширяет возможности их практического использования в биотехнологии.

Хитин-меланиновый комплекс, как и хитин способны эффективно связывать тяжелые металлы, радионуклиды и другие поллютанты и могут найти применение в качестве сорбента для очистки воды, почвы от этих антропогенных загрязнителей [45].

Хитозан может быть использован в качестве элиситора для предпосевной обработки семян различных сельскохозяйственных растений, а также для конструирования современных ранозаживляющих средств [67].

Литература

1. Скрябина, К. Г. Хитозан / Под. ред. К. Г. Скрябина, С. Н. Михайлова, В. П. Варламова. – М: Центр «Биоинженирия» РАН. – 2013. – 574 с.

2. Chapman, R.F. The insects. Structure and function / R. F. Chapman – London: The English universities press. – 1969. – 600 р.

3. Получение хитина и хитозана из медоносных пчел / С. В. Немцев и др. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004 – Т. 40, № 1. – С. 46–50.

4. Курченко, В. П. Физико-химические и биологические свойства меланиновых пигментов / В. П. Курченко, Т. А. Кукулянская, Д. А. Новиков // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы VII Междунар. конф. – М.: ВНИРО. – 2003. – C. 23–31.

5. Сорбция тяжелых металлов высшими грибами и хитином разного происхождения в опытах in vitro / М. Е. Маркова и др. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2008. – № 6. – С. 118–124.

6. Модулирование болезнеустойчивости растений с помощью низкомолекулярного хитозана / Н. И. Васюкова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2001. – Т. 37, № 1. – С. 115–122.

7. Baldrick, P. The safety of chitosan as a pharmaceutical excipient / P. Baldrick // Regulatory Toxicology and Pharmacology. – 2010. – V. 56. – P. 290–299.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНА CYP6A13

ТЛЕЙ MYZUS PERSICAE (SULZER, 1776)

М. М. ВОРОБЬЕВА, Д. В. ГАЛИНОВСКИЙ, С. А. БЕЛАЯ, Н. В. ВОРОНОВА

Белорусский государственный университет, г. Минск,

e-mail: masch.89@mail.ru

Введение. Во всех регионах мира, в том числе в Беларуси, насекомые-фитофаги представляют серьезную угрозу для растений как возделываемых, так и свободно произрастающих. Особенно опасны в этом отношении насекомые, например, настоящие тли (Aphididae), выступающие переносчиками вирусов растений. Несмотря на то, что растения в процессе коэволюции с вредителями выработали целый ряд защитных приспособлений, их устойчивость не является абсолютной и может преодолеваться насекомыми. Некоторые виды тлей способны поражать большинство рецентных видов растений, включая токсичные, листья которых содержат алколоиды и терпены, известные инсектицидными и репеллентными свойствами. Данная способность тлей проявляется в силу особенностей биологии тлей (телескопического партеногенеза и способности к анголоциклии) и характера питания (в первую очередь, флоэмососущих тлей).

Как известно [1], за нейтрализацию фитотоксинов, попадающих в организм насекомого в процессе питания соком растений, отвечают белки суперсемейства цитохромов р450 [2]. Количество генов CYP450, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков, у насекомых может значительно варьировать: от 85 у тлей Acyrthosiphon pisum (Harris, 1776) до 114 − у Myzus persicae (Sulzer, 1776). Было показано, что у M. persicae, адаптированных к питанию на растениях табака, наблюдается вторичная амплификация генов CYP6, проходящая без видимого метаболического ущерба [3]. Как полагают, эта особенность позволяет M. persicae питаться не менее чем на 1327 видах растений, принадлежащих к 109 различным семействам и отличающихся между собой содержанием и составом вторичных метаболитов [4]. Изучение 6-го семейства суперсемейства CYP450 и их белковых продуктов представляет актуальную задачу, поскольку данные ферменты отвечают как за метаболизм фитотоксинов, так и за нейтрализацию ксенобиотиков у тлей и могут обеспечивать устойчивость к ним.

Цель настоящего исследования − клонировать ген, ассоциированный с устойчивостью к инсектицидам у тлей M. persicae, а именно ген СУР6А13.

Материалы и методика исследований. В работе были использованы лабораторные линии тлей M. persicae с редьки черной (Raphanus sativus L., 1753), перца овощного (Сapsicum annuum L., 1753) и моркови посевной (Daucus carotasub sp. sativus (Hoffm.) Arcang, 1882).

Для выделения РНК использовали коммерческий набор «GeneJET RNA Purification Kit» (Thermo Scientific). Концентрацию препаратов РНК оценивали спектрофотометрически (Ultrospec 3300pp, Швеция). Синтез кДНК осуществили с использованием набора реагентов «Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit» (Thermo Scientific), используя в качестве матрицы РНК, предварительно очищенную от геномной ДНК. ПЦР провели с использованием собственных праймеров CYP6A13f7/ CYP6A13r8 [5], позволяющих амплифицировать участок белок-кодирующей области гена СУР6А13 длиной 1132 п.н.

ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл следующего состава: 200 мкМ dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 2,5 мкМ MgCl2, 1×PCR Buffer, 1 ед. Taq-полимеразы и 0,5 мкг матрицы. ПЦР проводили в режиме: 94°С – 5 мин; 35 циклов по 94°С – 1 мин, 45°С – 1 мин, 72°С – 2 мин; 72°С – 10 мин. Электрофорез проводили в 1,5% агарозном геле. Для выделения из агарозного геля фрагмента ДНК нужной длины использовали набор «GeneJET Gel Extraction Kit» (Thermo Scientific). Концентрацию ПЦР-продуктов оценивали по интенсивности флуоресценции сравнением с маркерными фрагментами известной концентрации.

Для клонирования использовали набор «CloneJET PCR Cloning Kit» (Thermo Scientific), включающий плазмиду pJET1.2. Плазмиду, несущую интересующую вставку, вводили в клетки E. сoli XL1-Blue по методике с использованием 0,1 М CaCl2. Высев бактерий проводили на полноценную агаризованную LB-cреду, содержавшую ампициллин в концентрации 50 ед/мл. Полученные бактерии проверяли на наличие плазмиды со вставкой нужного размера методом ПЦР (можно подробнее, если место позволяет) и последующим электрофоретическим разделением ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле. В качестве флуоресцентного красителя использовали ZUBR-Green (Праймтех, Беларусь), длину фрагментов определяли относительно маркера молекулярного веса 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).

Результаты исследований и их обсуждение. В работе выделили общую РНК из изолированных лабораторных линий тлей M. persicae, которых культивировали на разных кормовых растениях, отличающихся между собой содержанием токсичных вторичных метаболитов (перец овощной, морковь посевная и редька черная). На электрофореграмме (рисунок 1) представлены образцы РНК из перца овощного (лунки П1−4), моркови посевной (П5−6 лунки) и редьки черной (П7−8 лунки). В таблице представлены результаты измерения оптической плотности и концентрации РНК данных образцов.

Рисунок 1 – Электрофореграмма препаратов РНК, выделенной из тлей M. persicae

№	Кормовое растение	λ 260	λ 280	λ 320	Концентрация РНК мкг/мл
П1	Перец овощной	0,059	0,035	0,08	32,5
П2	Перец овощной	0,107	0,060	0,012	60,5
П3	Перец овощной	0,048	0,032	0,015	23,0
П4	Перец овощной	0,100	0,058	0,014	55,0
М1	Морковь посевная	1,506	0,838	0,015	954
М2	Морковь посевная	0,263	0,150	0,013	159,5
Р1	Редька черная	2,118	1,167	0,016	1345
Р2	Редька черная	0,044	0,031	0,018	16,5

Образцы П3 и Р2 имели низкую концентрацию РНК, поэтому были исключены из дальнейшей работы. На основе оставшихся образцов РНК синтезировали кДНК. Для синтеза брали аликвоту, содержавшую 0,5 мкг РНК, очищенной от геномной ДНК. Далее полученную к ДНК использовли в качестве матрицы для синтез фрагмента гена

Таблица – Характеристика препаратов РНК, выделенных из тлей M. Persicae (или полноразмерного гена) СУР6А13. В результате амплификации были получены ПЦР-продукты ожидаемой длины для линии тлей, с каждой культуры. Для очистки целевых фрагментов ДНК от неспецифических продуктов амплификации, ПЦР-продукт размером около 1,1 т.п.н. экстрагировали из геля. Концентрацию фрагментов нужного размера оценили по интенсивности флуоресценции: в образцах с редьки черной и моркови посевной она составила 10 нг/мкл, с перца овощного – 9 нг/мкл.

Перед лигированием ПЦР продукта с плазмидой провели ферментативную реакцию отщепления концевого неспецифического нуклеотида, который присоединяется ферментом Taq-полимеразой в процессе синтеза ПЦР-продукта. Фрагменты кодирующей области гена СУР6А13 из тлей, собранных с моркови, клонировали в вектор pJET1.2 (полученная плазмида обозначена pJET-6) в клетки бактерий E. сoli XL1-Blue. Для тлей с других растений клонировать фрагмент не удалось.

Для подтверждения размера вставки в составе полученной плазмиды проводили ПЦР с плазмидой pJET-6 в качестве матрицы и праймерами к полилинкеру данной плазмиды. На электрофореграмме (рисунки 2) виден фрагмент нужного размера, полученного из тлей, собранных с моркови посевной.

1, 2 − вставка размером 1132 п.н.; 3 – положительный контроль (содержит вставку контрольного фрагмента); 4 − отрицательный контроль (не содержит матрицы)

Рисунок 2. – Элекрофореграмма продуктов ПЦР клонированного фрагмента

Заключение. Ген CYP6A13 тлей M. persicae был успешно клонирован с использованием праймеров CYP6A13f7/ CYP6A13r8 для получения целевого фрагмента длиной 1132 п. н.

Литература

1. Feyereisen, R. Insect CYP Genes and P450 Enzymes / R. Feyereisen // Insect molecular biology and biochemistry / ed. L. I. Gilbert. – Elsevier, 2012, Ch. 8.  P. 236–295.

2. Despres, L. The evolutionary ecology of insect resistance to plant chemicals / L.Despres, J. P.David, C. Gallet // Trends in Ecology and Evolution. – 2017. – Vol. 22, Iss. 6. – P. 298–307.

3. Comparative analysis of detoxification enzymes in Acyrthosiphon pisum and Myzus persicae/ J. S. Ramsey [et al.] // Insect Mol. Biol. – 2010. – Vol.19. – P. 155–164.

4. Holman, J. Host plant catalog of aphids. Palaearctic region / J. Holman // Berlin: Springer Science, 2009, Germany, – 1216 pp.

5. Белая, С. А. Разработка праймеров для амплификации генов 4 и 6 семейств цитохромов р450 тлей (Heminoptera: Rhinchota: Aphidoidea) / С. А. Белая // Научные стремления: материалы V Междунар. науч.-практ. конф. – 2014. – Минск, 2014. – С. 17−20.

АНТИМИКРОБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ

В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ