Правець

 

Правець (стовбняк) - гостра ранова інфекція людей і тварин, що розвивається в результаті ураженя нейротоксином рухових клітин спинного і головного мозку, проявляється розвитком тонічних і тетанічних скорочень м'язів.

 Морфологія. Clostridium tetani — пряма рухлива паличка зав­довжки 2,4—5 мкм і завширшки 0,5—1,1 мкм. Має включення у вигля­ді зерен, розташованих на кінцях і центрально; перитрих, утворює стійкі спори кулястої форми, які розташовані на кінці і надають мік­роорганізму вигляду барабанної палички. Не утворює кап­сули, грампозитивна.

Культивування. Клостридії правця — строгі анаероби. На цук­ровому або кров'яному агарі (рН 7,0—7,9) ростуть при температурі

37 °С (границі росту — 14 і 45 °С) у вигляді ніжних нальотів з компактним центром і нит­коподібними відростками по периферії; іноді навколо колоній утворюється зона гемолізу. Збудник правця спричиняє почорніння мозкового середовища і вісмутсульфітагару. При висіванні уколом у стовпчик агару спостерігається ріст у вигляді ялинки або пензлика з появою ніжних колоній. Середовище Кітта—Тароц-ці внаслідок розщеплення білків мутніє з утво­ренням газу і своєрідного запаху при культи­вуванні.

Токсиноутворення. Збудник правця виробляє надзвичайно силь­ний екзотоксин, який складається із двох фракцій: тетаноспазміну, що уражує клітини нервової тканини і спричиняє спазматичне скоро­чення м'язів, і тетанолізину, який розчиняє еритроцити. Тетаноспаз-мін належить до класу частково секретованих, частково зв'язаних з  клітиною екзотоксинів.

Антигенна структура. Клостридії правця серологічно неоднорідні, відомо 10 сероварів. Усі вони продукують ідентичні екзотоксини. Серовари 1, 3, 6, 7 мають виражену специфічність. Рухливі штами містять Н-антиген, нерухомі — тільки О-антиген. Поділ клостридіи правця на серовари роблять за Н-антигеном, а на серогрупи — за О-антигеном.

Резистентність. Вегетативні форми збудника правця гинуть при температурі 60—70 °С протягом ЗО хв і досить швидко знешкоджуються від дії всіх дезинфікуючих речовин. Спори клостридіи правця мають велику стійкість. Вони довго зберігаються у грунті і на різних пред­метах, витримують кип'ятіння протягом 10—90 хв, а спори деяких штамів — 1—3 год; 5 % розчин фенолу спричиняє їх загибель через 8—10 год, 1 % розчин формаліну — через 6 год; дію прямого соняч­ного випромінювання спори витримують 3—5 діб.

Патогенність для тварин. У природних умовах на правець хворі­ють коні, дрібна рогата худоба. Багато тварин є носіями збудника правця. З експериментальних тварин до клостридіи правця сприйнят­ливі білі миші, морські свинки, пацюки, кролі і хом'яки.

Патогенез захворювання у людини. Джерелом збудника є тварини і люди, які виділяють клостридії- з випорожненнями в грунт. Спори клостридіи правця виявляють у грунті в 20—80 % досліджених проб, у деяких випадках — у 100 %. Особливо багатий на спори угноєний грунт. Вони можуть розноситись разом з пилом, проникати в житло, потрапляти на верхній одяг, білизну, взуття та інші предмети.

Захворюваність на правець пов'язана з травматизмом воєнного і мирного часу. Інкубаційний період 4—14 діб.

Близько 2/3 захворілих становлять особи, зайняті в сільському господарстві, понад 1/3 — діти віком 1—15 років. Більше половини захворювань на правець виникає в результаті поранень ніг лопатою, цвяхом, стернею під час роботи в полі, на городі.

У новонароджених збудник інфекції може проникати через пуп­ковий канатик, у породіль — через слизову оболонку матки.

На місці проникнення спори клостридій перетворюються у веге­тативні форми, які виділяють екзотоксин. У ряді випадків правець супроводиться   розвитком  бактеріемії.

Правцевий токсин надходить у кров і гематогенним шляхом розпов­сюджується по всьому організму, зумовлюючи послідовне подразнення периферичних нервових закінчень і рухових центрів спинного мозку.

Захворювання починається із судорожних скорочень м'язів у місці проникнення збудника, потім настає тонічне скорочення жу­вальних (тризм), мімічних (risussardonicus) і потиличних м'язів; далі у процес втягуються м'язи шиї, спини (opistotonus) і кінцівок

Розвивається клінічна картина низхідного правця. Смерть настає від асфіксії і порушення функції органів кровообігу, травної системи та ін. Летальність становить 35—70 %.

Імунітет. Постінфекційний імунітет при правцю переважно анти­токсичний, слабконапружений; можливе повторне захворювання.

Лабораторна діагностика. Мікробіологічні дослідження з метою діагностики правця проводять рідко. Клінічна картина хвороби настільки характерна, що необхідність вдаватись до бактеріологічної діагностики просто відпадає. Лише у випадках нетипового або летального її перебігу, при розвитку правця після підпільних абортів чи пологів у домашніх умовах а також коли виникає правець новонароджених такі дослідження необхідно рекомендувати. Значно частіше проводять виявлення C. tetani у шовних і перев'язувальних матеріалах, лікарських препаратах для парентерального введення, у пробах грунтів тих регіонів, де реєструється висока захворюваність на стовбняк.

Взяття матеріалу. Від хворих на дослідження беруть  гній, рановий вміст, ескудат, шматочки некротизованих тканин, тампони з рани, інородні тіла; від померлих - кров, рановий вміст, старі рубці, селезінку. У випадках виникнення правця після абортів і пологів досліджують виділення і біоптати з вагіни і матки; при захворюванні новонароджених - виділення з пупка. Всі матеріали негайно направляють до бактеріологічної лабораторії краще в спеціальних транспортних середовищах, захистивши їх від згубної дії кисню повітря.

Первинна бактеріоскопія. Із патологічного або секційного матеріалів виготовляють декілька мазків та препаратів-відбитків, забарвлюють за Грамом, Ожешко (для виявлення спор) і мікроскопують під імерсійною системою. Наявність у мазках довгих грампозитивних паличок з круглими термінальними спорами при відповідній клінічній картині дає змогу запідозрити присутність C. t etani (рис.8).

Але на осові лише мікроскопічного дослідження не можна робити висновок, оскільки в матеріалі можуть бути подібні за морфологією непатогенні мікроорганізми (C. pseudotetanicum, C. tetanomorphum).

Бактеріологічне і біологічне дослідженя. Отриманий в лабораторії матеріал розтирають у стерильних ступках із піском, добавляючи середовище для контролю стерильності до отримання 10 % суспензії. Рідку фазу матеріалу розділяють на дві рівні частини, одну з яких прогрівають при 80 ⁰С протягом 20 хв. Це приводить до загибелі вегетативних клітин бактерій і значно підвищує шанси на виділення C. tetani. Далі грітий і негрітий матеріал досліджують паралельно.

Для накопичення анаеробних клостридій обидві порції висівають у дві пробірки з середовищем Кітта-Тароцці (або тіогліколевим бульйоном). Одночасно для отримання ізольованих колоній роблять посів на чашку з анаеробним кров'яним агаром такого складу: до еритрит - агару добавляють 10 % середовища 199, 10 мкг/мл менадіону, 10 мкг/мл геміну, 10 мг/мл цистину, 0,1 % твіну - 80 і 5 % дефібринованої крові барана або кролика. При сильному забрудненні проб сторонньою мікрофлорою до агару ще додають неоміцин, гентаміцин або налідиксову кислоту в кількості 40-50 мкг/мл.

Посіви інкубують в анаеробних умовах при температурі 37 ⁰С протягом 48-72 год. Колонії C. tetani на кров'яному агарі плоскі, напівпрозорі з нерівними краями, нерідко у вигляді переплетенних ниток, що нагадують павучків. Навколо колоній виникає зона гемолізу (рис.9). Якщо колонії відсутні, роблять висів із середовищ накопичення на кров'яний агар. При посіві уколом у високий стовпчик цукрового агару колонії C. tetani нагадують хмаринки або жмуточки вати.

Виділену чисту культуру ідентифікують за морфологічними, культуральними ознаками і обов'язково шляхом визначення токсигенності, яка є вирішальним тестом при діагностиці правця. Для виявлення токсичної дії культури або первинного досліджуваного матеріалу ставлять біологічну пробу нейтралізації токсину правцевою сироваткою на тваринах.

Правцевий токсин отримують шляхом вирощування культури в середовищі Кітта-Тароцці протягом 2-3 діб з наступною фільтрацією або центрифугуванням бульйону. Двом білим мишам внутрішньом'язево (біля кореня хвоста) вводять по 0,5 мл суміші фільтрату з правцевою антитоксичною сироваткою (200 МО). Суміш попередньо витримують у термостаті 40-60 хв. Спостереження за мишами проводять протягом 4-5 діб. Якщо у фільтраті містився правцевий екзотоксин, заражені миші гинуть  при явищах висхідного правця. Контрольні тварини залишаються живими. Аналогічно біопробу ставлять і з дісліджуваним матеріалом (розтерті в ізотичному розчині шматочки тканин, гній, ексудат тощо). Виникає така ж сама клінічна картина правця, як і після введення токсину (рис. 10, а антисироватка нейтралізує присутній токсин.

Для виявлення правцевого токсину в середовищах накопичення а також для ідентифікації виділеної чистої культури C. tetani використовують високоспецифічну й більш економічну реакцію непрямої гемаглютинації. У ряді лунок полістиролової пластини роблять розведення культуральної рідини в буферному розчині з кролячою інактивованою сироваткою від 1 : 10 до 1 : 1280. Потім у кожну лунку вносять по 0,1 мл правцевого еритроцитарного антитільного діагностикуму (суспензія еритроцитів барана сенсибілізованих правцевою антитоксичною сироваткою). Пластини з лунками вміщують у термостат на 60 хв, потім залишають при кімнатній температурі. Попередній результат враховують через 3 год, остаточний - через 18 год. При наявності правцевого токсину в ряді лунок появляється феномен гемаглютинації.

Для ідентифікації C. tetani в різних об'єктах можна використовувати люмінесцентно-серологічний метод, застосувавши протиправцеву антимікробну сироватку, мічену ізотіоціанатом флуоресцеїну, а також метод імуноферментного аналізу.

Спеціально для виділення чистої культури збудника правця Філдс запропонував оригінальний спосіб: кілька крапель прогрітого при 60 ⁰С протягом 90 хв досліджуваного матеріалу або культури із рідкого середовища накопичення сіють у конденсаційну рідину на дні пробірки зі скошеним кров'яним чи сироватковим агаром. Посів вирощують 18-24 год в умовах строгого анаеробіозу. Збудник правця завдяки своєму повзучому росту, обумовленому джгутиками, росте у вигляді тоненької плівки по всій поверхні середовища. З верхньої частини плівки роблять 3-5 таких пересівів до отримання чистої культури.

Серологічний метод діагнотсики правця практично не використовується. Лише для контролю ефективності вакцинації правцевим анатоксином (визначення рівня антитоксину в крові) вибірково проводять постановку реакції нейтралізації, РНГА, ІФА.

Лікування. Антитоксичну протиправцеву сироватку (50 000— 100 000 МО) вводять внутрішньом'язово. Більш   ефективне застосування гамма-глобуліну крові людей, імунізованих проти правця. За­стосовують також антибіотики (пеніцилін, цефалоспорини).

Щоб запобігти розвиткові правця при травмах, проводять хірургіч­ну обробку ран, вводять 0,5 мл анатоксину і 3000—10 000 МО анти­токсичної сироватки; в разі тяжкої травми протиправцеву сироватку доцільно призначати і прищепленим особам. Повну дозу сироватки вводять після попередньої внутрішньошкірної проби на чутливість організму до кінського білка (методика дробного введення сироватки описана в інструкції, що додається до кожної ампули).

Дуже важливим заходом вважають застосування полісистемної комплексної терапії, спрямованої на відновлення порушених функцій організму.

Хворих госпіталізують в окремі палати реанімаційного відді­лення, де забезпечується режим, який виключає зовнішні подразники (шум, світло), призначають препарати, що. зменшують приступи судо­рог або повністю запобігають їм (нейролептики, транквілізатори, хлоралгідрат, курареподібні препарати), а також засоби для підтри­мання функції органів кровообігу, здійснюють оксигенотерапію та інші необхідні заходи. В результаті такої терапії летальність у до­рослих знизилась до 17—-18%, а в новонароджених — більш ніж у  два   рази.

При повторній легкій травмі (не пізніше 14-ї доби) вторинне вве­дення протиправцевої сироватки після першої профілактичної дози не рекомендується, оскільки є небезпека розвитку сироваткової хвороби або анафілактичного  шоку.

Профілактика полягає в запобіганні травмам на виробництві і в побуті.

Активну імунізацію роблять правцевим анатоксином; для специ­фічної профілактики правця у дітей використовують коклюшно-дифтерійно-правцеву вакцину, асоційований дифтерійно-правцевий анатоксин, хімічну сорбовану тифозно-паратифозно-правцеву вак­цину.

Щеплення роблять усім дітям з 3 місяців життя, сільським жите­лям певних районів (за епідеміологічними показаннями), будівель­никам, лісозаготівникам, робітникам водопровідних і очисних споруд, підприємств для переробки торфу, працівникам залізничного транс­порту. Надалі через 1,5—2 роки, 6 і 11 років проводять ревакци­націю.

Середовища для культивації клостридій

Середовище Кітта-Тароцці. М'ясо або печінка великої рогатої худоби нарізають дрібними шматочками, заливають трикратним об'ємом МПБ або бульйон Хоттінгера (рН 7,4—7,6) і 30 хвилин кип'ятять. Потім середовище фільтрують, печінка (м'ясо) промивають водопровідною водою, підсушують фільтрувальним папером. По 3-4 шматочки м'яса (печінки) поміщають в пробірку, наливають 7-8 мл бульйону, покривають шаром вазелінового масла і стерилізують при 120°С 20 хвилин. Перед використанням середу регенерують (кип'ятять з наступним охолодженням).

Кров'яний агар з глюкозою. До 3%-ному МПА (рН 7,2—7,4), розплавленого і охолодженого до 50°С, додають до 1-2% стерильного розчину глюкози, 15-20% свіжої дефібрінірованной крові барана або коня. Розливають по чашках Петрі, підсушують 20-30 хвилин в термостаті. Культивування проводять в анаэростате.

Напіврідкий агар для суворих анаеробів (Тароцци). У бульйон Мартена (рН 7,2-7,4) з 0,3-0,5% глюкози додають 0,1% агару. Середовище розливають по 9 мл в стерильні пробірки з шматочками вареного м'яса, печінки або фаршу, стерилізують при 120°С 30 хвилин. Середовище можна використовувати, не заливаючи поверхню вазеліновим маслом.

Агар для трубок Виньял-Вейона. У бульйоні Мартена (рН 7,4) розчиняють 2% агару, 0,1% глюкози. Середовище розливають у вузькі тонкостінні пробірки і стерилізують дрібно, текучим паром протягом 3 днів.

Бульйон Вейнберга для анаеробів. 1 кг бичачого серця пропускають через м'ясорубку, додають до фаршу 1 л води, нагрівають до кипіння, охолоджують, знімають жир. Змішують 400 г печінки, 400 г свинячих шлунків, 40 г соляної кислоти, 4 л води, підігрітої до 50°С, і витримують при цій температурі 18-24 год. Потім підігрівають до 100°С, рідину зливають, фільтрують, додають 0,2% двоосновного фосфорнокислого натрію і встановлюють рН 7,4. Змішують 1 л м'ясної води із серця бика і 2 л отриманого пептона, встановлюють рН 7,8—8,2 і стерилізують при 120°С 30 хвилин. Бульйон розливають по пробірках з шматочками вареної печінки, наливають стерильне вазелінове масло шаром 0,5 см і знову стерилізують при 120° С 30 хвилин. Перед посівом до бульйону додають стерильний розчин глюкози до 0,5%.

Середовище Віліса і Хоббе. Змішують 400 мл бульйон Хоттингера, 4,8 г агару, 4,8 г лактози, 1,3 мл 1%-ного розчину нейтрального червоного. Стерилізують при 115°С 15 хвилин, охолоджують до 50°С і додають 15 мл стерильної жовткової суспензії (змішують порівну курячий жовток і фізіологічний розчин) і 60 мл стерильного знежиреного молока.

Залізо-сульфітний агар (Вільсон, Блер, 1924). До 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) з 1% глюкози при температурі 60°С, додають 10 мл 20%-ного розчину сірчанокислого натрію (Na2SO3) і 1 мл 8%-ного розчину хлористого заліза (FeCl3), приготовленого на стерильній дистильованій воді. Розчин Na2SO3 попередньо стерилізують 1 год текучим паром. Потім середу, не стерилізуючи, розливають по чашках Петрі. Сірчанокислий натрій можна замінити сірчанокислим натрієм (Na2S2O3), а хлористе залізо—сірчанокислим (FeSO4). При відновленні Na2SO3 сульфат натрію з'єднується з хлорним залізом і утворюється чорний осад сірчистого заліза (FeS). Цією здатністю володіють анаероби і деякі аеробні бактерії, внаслідок чого колонії таких мікроорганізмів забарвлюються в чорний колір. С. perfringens, володіє великою швидкістю росту, змінює колір середовища через 1-2 год культивування. Інші анаероби формують зеленувато-чорні колонії через 6-7 г.

Залізо-сульфітне молоко (Робінзон, Стоваль, 1937). До 100 мл знежиреного молока додають 10 мл 20%-ного розчину серністокіслий натрію і 1 мл 8%-ного хлористого заліза. Середовище готують безпосередньо перед використанням і розливають по пробірках. На даній середовищі С. perfringens можна виявити в суміші зі стрептококами, які на інших середовищах здатні помітно гальмувати його зростання.

Бензидино-кров'яний агар (Гордон, Мак Леод, 1940). До 3%-ному МПА (рН 6,4) з 1% глюкози, подогретому до температури 50°С, додають бензидин до концентрації 9% і 10% стерильної дефібрінірованной крові барана. Компоненти перемішують до придбання середовищем шоколадного відтінку, розливають по чашках Петрі і підсушують 4-5 год в термостаті. Засіяні чашки витримують в анаеробних умовах в термостаті 12-24 год, а потім переносять у аеробні умови. Колонії С. novyi забарвлюються в чорний колір за 15-30 хвилин. Розчин бензидину готують наступним чином: до 50 мл дистильованої води додають 0,25 г основного бензидину, 0,3 мл 1% HCl і нагрівають до розчинення. Розчин придатний для вживання протягом 2 тижнів.

Жовтково-кров'яний агар (Шапина-Вегина, 1962). До 2,5%-ному МПА додають 10% дефібрінірованной крові барана, 10% желточной суспензії. Середа призначена для виявлення С. novyi. Через 16 год вирощування колонії оточені непрозорою зоною гемолізу з наявністю на поверхні середовища навколо колоній непрозорої плівки з перловим блиском. Інші бактерії (аероби, анаероби), як правило, не дають одночасно перламутрового шару та зони редукції.

Напівсинтетичне середовище (Bonnel, Burgian, Raby, 1959). Використовують для культивування і швидкої селекції анаеробних бактерій. У 1000 мл дистильованої води розчиняють 15 г пептона, 5 г дріжджового екстракту, 2,5 г натрію хлориду, 1,3 г агар-агару і приймати Na2CO3. Суміш автоклавують при 120° С протягом 15 хвилин, фільтрують і додають 5,5 г глюкози, 0,5 г гідросульфіта натрію (попередньо розчинені в невеликій кількості води), встановлюють рН 7,1. Додають 0,001 г резазурина і суміш струшують протягом декількох хвилин. Середовище розливають у пробірки по 15 мл, стерилізують при 110°С 30 хвилин, охолоджують під холодною водою. При зростанні анаеробів середовище забарвлюється в нижній частині пробірки, факультативних анаеробів — весь стовпчик середовища. Середовище використовують 3 тижні при зберіганні в умовах кімнатної температури.

Натрію метабисульфат і залізо амонійно-цитратное є індикаторами редукції сульфіту, що впливає на формування колоній збудника чорного кольору діаметром 2-4 мм, Зростання інших сульфатредукуючих бактерій (сальмонели, протей, цитробактер, стафілококи, бацили) інгібується. На середовищі можуть рости ентерококи, але їх колонії по зовнішньому вигляду відрізняються від колоній С. perfringens.

Анаеробний агар Шадпера (пропис фірми «Дифко», 1982). У 1000 мл дистильованої води розчиняють 10 г триптического соєвого бульйону, 5 г пептона, 5 г дріжджового екстракту, 5 г декстрози, 0,4 г цистеїну гідрохлориду, 0,01 г геміну, 0,75 м трис-буфера, 13,5 г агару. Встановлюють рН 7,6, стерилізують автоклавуванням при 121°С 15 хвилин.

Триптозо-сульфітний циклосериновый агар (TSC-агар). В основній перфрінгенс-агар вносять D-циклосерин з розрахунку 400 мг/л та 50 мл/л желточной емульсії. Компоненти перемішують і готове середовище розливають у чашки Петрі.

Перфрінгенс-агар Шахиди—Фергусона (SFP-агар, пропис фірми «Дифко», 1982). В основній перфрінгенс-агар вносять наступні антибіотики: 12 мг/л канаміцин-сульфат, 30000 ОД/л поліміксин В сульфату і 50 мл/л желточной емульсії. Готове середовище розливають у чашки Петрі. На обох вказаних середовищах навколо чорних колоній С. perfringens утворюється опалесцююча зона, яка вказує на лецитиназную активність мікроорганізму.

Анаеробний бульйон Шадлера (пропис фірми «Дифко», 1982). За складом середовище аналогічна анаеробного аґару Шадлера, але з неї виключений агар. Використовують для вирощування патогенних анаеробів, для визначення антибіотикостійкості анаеробів методом розведень з виразом результату у вигляді МІК.

Тиогликолевый бульйон (пропис фірми «Дифко», 1982). У 1000 мл дистильованої води розчиняють 0,5 г L-цистину, 2,5 г натрію хлориду, 5,5 г декстрози, 5 г дріжджового екстракту, 15 г панкреатичного перевара казеїну, 0,5 г натрію тиогликолята. Встановлюють рН 7,1, розливають по ємностей і стерилізують при 121°С 15 хвилин. Перед використанням середу кип'ятять і охолоджують.

Анаеробний агар Уілкінс-Чангрена (пропис фірми «Дифко», 1982). У 1000 мл дистильованої води розчиняють 10 г триптона, 10 г желатинового пептона, 5 г дріжджового екстракту, 1 г декстрози, 5 г натрію хлориду, 1 г L-аргініну, 1 г натрію пірувату, 0,0005 г менадіона, 0,005 г геміну, 10 г агару. Встановлюють рН 7,1, стерилізують при 121°С 15 хвилин.

Середа рекомендується для ізоляції анаеробних мікроорганізмів з клінічних матеріалів, є стандартною для визначення анткбиотикочувствительности анаеробних бактерій. При виключенні агару середовище може бути використана як поживний бульйон.

Збагачений клостридиальный агар (RCM-агар, пропис фірми «Дифко», 1982). У 1000 мл дистильованої води розчиняють 3 г дріжджового екстракту, 10 г м'ясного екстракту, 10 г пептона, 5 г декстрози, 1 г розчинного крохмалю, 5 г натрію хлориду, 3 г натрію ацетату, 0,5 г цистеїну гідрохлориду, 15 г агару. Встановлюють рН 6,8, стерилізують при 121°С 15 хвилин.

Середа рекомендується для дослідження кишкової мікрофлори. Perry et al. (1955) використовували її для вивчення рубцевих стрептококів, Bornes, Goldberg (1962), внісши до складу хлортетрацикліну гідрохлорид або натрію азид, застосовували середовище для дослідження фецес курей. З домішками крові вона придатна для виявлення в фецес тварин і людей лактобацил, з домішками крові та неоміцину — бактероїдів.