6.2. Кинетика процессов связывания молекул ксенобиотика с мембранными центрами

Ряд ксенобиотиков вызывает биологическую реакцию, взаимодействуя с определенными местами связывания на мембране. Анализ развития мембранотропных эффектов должен опираться на совокупность модельных представлений, отражающих течение двух основных этапов: связывание молекул эффектора с некими центрами сродства (рецептор), инициирующими процесс, и последующее развитие реакции (биологический ответ).

При рассмотрении взаимодействия химического агента с биологическими мембранами объектами анализа оказываются процессы доступа эффектора к мембраноактивным центрам, сам акт их взаимодействия и последующее развитие реакции (биологический ответ).

Обычно для анализа кинетических зависимостей в токсикологии и фармакологии используются соотношения, соответствующие случаю отсутствия диффузионных ограничений, т. е. процессы диффузии полагаются быстрыми в сравнении с развитием реакции.

В простейшем случае, предполагая, что образование комплекса лиганд (ксенобиотик)/мембраноактивный центр происходит при отсутствии диффузионных ограничений со стехиометрией 1:1 и независимости мест связывания друг от друга (образование комплекса с одним из мембраноактивных центров не влияет на взаимодействие остальных активных центров с молекулами лиганда), реакция связывания лиганда А с активным сайтом (рецептор) R запишется в виде:

k

R + A RA, (6.3)

k'

где k, k' – константы скоростей прямой и обратной реакции соответственно.

Полагая общую концентрацию мест связывания – рецепторов (занятых и незанятых) в данной системе, равной Q, при концентрации эффектора С, имеем следующее равенство для скорости изменения концентрации Z-комплексов лиганд-рецептор во времени в условиях избытка лиганда (С >> Q):

dZ

––– = k (Q – Z)C – k'Z. (6.4)

dt

В равновесии dZ/dt = 0 и

QC

Z^равн = ––––– . (6.5)

K + C

Следовательно, когда процессы диффузии оказываются быстрыми в сравнении с развитием биологической реакции, образование комплексов опишется уравнением

QC

Z(t) = –––––– [1 – e^{- (k'-kC) t}], (6.6)

K + C

а процесс разрушения комплексов –

Z(t) = Z₀e^{-k' t}, (6.7)

где k и k' – прямая и обратная константы скоростей образования комплекса Z; Q – концентрация мембраноактивных центров; С – концентрация эффектора.

Кривые, описываемые этими уравнениями, изображены на рис. 6.3.

Рис. 6.3. Концентрационная зависимость связывания эффектора с мембраноактивным центром (1) и диссоциация комплекса при удалении эффектора (2). Стрелкой ( ↑ ) указан момент удаления лиганда

Отношение констант k’/ k = К называется константой равновесия комплекса. Она равна концентрации эффектора, вызывающей половинное насыщение мест связывания. В самом деле, если С = К, то, как следует из уравнения (6.5),

QК

Z = ––––– = Q/2. (6.8)

K + К

Скорость образования комплексов во времени будет тем большей, чем выше концентрация эффектора (6.6). Скорость же распада от нее не зависит (6.7).

Мы рассмотрели простейший случай локализации рецепторов прямо на поверхности мембраны. Но часто кривая развития процесса имеет S-образную форму (рис. 6.4). В этом случае для интерпретации наблюдаемых зависимостей используется ряд подходов.

Рис. 6.4. Концентрационная зависимость связывания эффектора с мембраноактивными центрами

Один из них – это модель «биофазы». «Биофаза» – располагающийся внутри мембраны компартмент, содержащий рецепторы и находящейся в контакте со средой. Описание процесса проводят на базе балансовых уравнений (так, как это принято в фармакологии и токсикологии). В этом случае можно записать систему дифференциальных уравнений, характеризующих динамику перемещений эффектора в компартмент при стехиометрии 1: 1следующим образом:

Рис. 6.5. Схема процесса взаимодействия эффектора с рецепторными структурами (модель «биофазы»)

dс

– ––– = k₁С(B – с) – k₁´с – k₂´с(Q – Z) + k₂´Z – k₃ с

dt

dZ

–––– = k₂ с (Q – Z) – k₂´Z, (6.9)

dt

где с – концентрация эффектора в биофазе; B – предельная емкость биофазы; k_i, k_i´ – константы скоростей реакций, смысл которых ясен из рис. 4.5.

Стационарная величина количества образовавшихся комплексов окажется равной

QСB/ (B+К₁)

Z = ––––––––––––––––––––––, (6.10)

С + (K₂ + К₂/К₁)( B+К₁)

где К₁ = k₁´/k₁ – коэффициент распределения эффектора между биофазой и средой, содержащей эффектор в концентрации С; К₂ = k₂´/k₂ – константа диссоциации комплекса.

При очень малых концентрациях эффектора С и сравнительно небольших значениях К₁ и К₂ можно предположить Q > Z, B > C и система (4.9) упрощается:

dс

–––– = k₁СB – с – k₂Q с + k₂´Z,

dt

(6.11)

dZ

––– = k₂ Qс – k₂Z,

dt

где  = k₁С + k₁´ + k_3.

Процесс отмыва связанного эффектора после перенесения тестового объекта в контрольный раствор описывается уравнением

₂ ₁

Z = Z_о (———e^-1t – ———e^-2t), (6.12)

₂ – ₁ ₂ – ₁

где ₁ = [k₂´ +  + k₂Q – ( k₂´ +  + k₂Q)² + 4 k₂´]/2,

₁ = [k₂´ +  + k₂Q + ( k₂´ +  + k₂Q)² + 4 k₂´]/2. (6.13)

Решения с различными приближениями приводят к описаниям кривых, характеризующихся наличием лаг-фазы (см. рис. 6.4). Аналогичный результат дает также численное интегрирование системы (6.9).

Рассмотренные выше примеры предполагают связывание с одним рецептором одной молекулы лиганда. В принципе можно допустить существование комплексов лиганд-рецептор RA_n с любыми стехиометрическими коэффициентами. Могут, например, существовать многовалентные места (рецепторы), образующие комплексы RA_n путем последовательного присоединения лигандов:

R +A = RA₁,

RA₁ + A = RA₂, (6.14)

. . . . . .

RA_n-1 +А = RA_n.

Если присоединение каждой последующей молекулы лиганда не зависит от количества ранее связанных с активным центром (рецептором) молекул, то данный процесс подчиняется уравнениям (6.4) и (6.5). В противном случае имеют место эффекты, обычно называемые кооперативными (например, связывание каждым рецептором двух молекул), причем кооперативность бывает отрицательной и положительной.

Когда присоединение каждой последующей молекулы облегчается вследствие посадки предыдущей, то говорят о положительной кооперативности, если, наоборот, затрудняется, – имеем отрицательную кооперативность.

Положительную кооперативность можно продемонстрировать на примере связывания кислорода молекулой гемоглобина, которая состоит из четырех субъединиц: двух - и двух -цепей. Каждая из субъединиц может связывать одну молекулу кислорода. Оказалось, что сродство к кислороду отдельного центра связывания (гема) тем выше, чем больше других центров связывания уже занято молекулами кислорода.

Существует несколько характерных приемов установления признаков кооперативности. Препарат рецепторов, насыщенный радиоактивным лигандом, можно перенести в среду, не содержащую его, и измерить скорость диссоциации «меченых» комплексов. При этом часть препарата помещается в раствор, содержащий высокую концентрацию немеченого лиганда, часть – в раствор без лиганда. Если в первом случае скорость распада комплекса выше, это может свидетельствовать о наличии отрицательной кооперативности: нерадиоактивный лиганд, связываясь со свободными, незанятыми радиоактивными рецепторами, ослабляет меченые комплексы. И наоборот, если в присутствии нерадиоактивного лиганда скорость диссоциации снижается, говорят о проявлении положительной кооперативности.

Можно рассчитать константы скорости связывания лиганда препаратом рецепторов при высоких и низких концентрациях; если они окажутся различными, это также можно рассматривать как признак кооперативности – положительной или отрицательной, в зависимости от того, в каком именно случае эта величина окажется больше.

Но самый популярный среди исследователей способ выявления кооперативности – это анализ характера отличий концентрационной зависимости количества связывающегося лиганда от классического уравнения (6.5). Представляя полученные данные в скэтчардовских координатах (рис. 6.6), при вогнутой кривой говорят об отрицательной кооперативности, при выпуклой – о положительной.

Рис.6.6. Скэтчардовские графики связывания эффектора с мембраноактивными центрами: отрицательная (1) и положительная (2) кооперативность

Предельному случаю сильно выраженной положительной кооперативности (n>1) соответствует популярное уравнение Хилла. Здесь речь идет о механизме, допускающем лишь одновременное присоединение всех молекул эффектора к рецептору без образования промежуточных комплексов RA₁, RA₂ … RA_n:

k

R + nA RA_n ,

k´

dZ

–––– = k (Q – Z)C ⁿ – k´Z , (6.15)

dt

QC ⁿ

Z^равн (C) = ––––

K + C ⁿ

Соотношение, описывающее образование комплексов, имеет вид:

QC ⁿ

Z (t) = –––––– [1 – e ^{(-k’+kCn) t}], (6.16)

K + C ⁿ

а диссоциация комплексов при отмыве:

Z(t) = Z_oe^-k’t . (6.17)

Следует отметить, что чем больше величина n, тем сильнее выражен S-образный характер кривой.