Афинная, или биоспецифическая, хроматография.

Особое место в жидкостной хроматографии занимает так называемая аффинная, или биоспецифическая, хроматография (от англ. affinity - сродство). Аффинная хроматография (АХ) основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Научные основы метода заложены в 1951 году в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности АХ были получены еще в 1910 году. Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы. В основе АХ лежит уникальное свойство биологически активных соединений узнавать строго определенные вещества, в процессе которого реализуется так называемый принцип молекулярного распознавания. Фермент узнает свой субстрат, антиген - антитело, гормон - рецептор. Как правило, каждый фермент катализирует определенный тип реакции. Возникновение соответствующего комплекса фермент - субстрат обусловлено строгим соответствием структур обоих участников комплексообразования.

Процесс разделения веществ с использованием АХ включает несколько самостоятельных этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем, ковалентно связанным с каким-либо биологически активным веществом (называемым аффинантом, или лигандом). В качестве носителей в АХ получили широкое распространение гранулированные гели агарозы и полиакриламида (биогель Р), полистирольные смолы с химически активными группами, целлюлоза и ее производные и т.д. Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ, к одному из которых иммобилизованный лиганд обладает биологическим сродством. Выбирая из смеси требуемое соединение, аффинант образует с ним комплекс. Остальные компоненты пройдут через колонку, не задерживаясь [4]. Специфически адсорбированный фермент может быть освобожден из комплекса изменением природы элюента, рН или ионной силы. На рис. 4 представлены основные этапы аффиной хроматографии. Лигандами могут служить самые различные соединения: белки, пептиды, аминокислоты, витамины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и многие другие вещества.

11

Иммобилизации лиганда на поверхности носителя обычно предшествует стадия его активации, то есть формирование реакционноспособных групп, взаимодействующих с лигандами. Непосредственное ковалентное связывание осуществляется редко, особенно если молекулы лиганда небольшие по размеру, что вызвано стерическими препятствиями из-за близкого расположения химически активных групп носителя. Для того чтобы погасить этот неблагоприятный эффект, связывание молекулы лиганда с поверхностью осуществляют через удлиняющий мостик, представляющий собой алифатическую цепочку из 2-10 атомов углерода. Активные группы носителя, оставшиеся несвязанными, блокируют соответствующими химическими агентами. Наиболее распространенный способ активации носителей, содержащих поверхностные гидроксильные группы, - обработка бромцианом в щелочной среде (рН ~ 11) (схема 1).

Образующиеся в результате имидокарбонатные группы легко присоединяют белки, пептиды и аминокислоты в качестве лигандов по их концевой свободной a-аминогруппе.

12