Методы выделения фагов

Прямой метод. Позволяет получить и изучить фаги в фильтратах исследуемого материала. О наличии и активности фага узнают по лизису чувствительной к нему тест-культуры.

Прямой метод, обычно, не дает убедительных результатов из-за малого количества фага, содержащегося в фильтрате. Для повышения его количества использу­ют методы обогащения.

Метод обогащения. Полученный фильтрат исследуемого материала вносят в 2-3 часовую бульонную культуру соответствующих микроорганизмов. Посевы инкубируют при 37 °С 18-24 часа. Бактериофаг размножается в клетках культуры и титр его значительно увеличивается. Затем бульон фильтруют и в филь­трате определяют свойства и активность фага.

Практическое применение фагов

Использование бактериофагов в медицинской практике основано на их строгой специфичности к инфицированию чувствительных микробных клеток. В соответствии с этим бактериофаги применяют для профилактики, лечения инфекционных заболеваний, а также идентификации и типирования их возбудителей.

Фагопрофилактика - способ предупреждения развития заболеваний в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов.

Фаготерапия - метод лечения инфекционных заболеваний, посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов к которым чувствительны возбудители. В настоящее время выпускают следующие препараты для лечения и профилактики:

- дизентерийный поливалентный;

- сальмонеллезный поливалентный групп А, В, С, В, Е;

- брюшнотифозный;

- стафилококковый;

- стрептококковый;

- синегнойный;

- протейный;

- клебсиеллезный;

- коли-фаг;

Также выпускают комбинированные препараты из нескольких видов бактериофагов:

- коли-протейный;

- пиобактериофаг;

- интести-бактериофаг;

- поливалентный (секстафаг).

Фагодиагностика - метод идентификации выделенных культур микроорганизмов, основанный на способности диагностических фагов лизировать чувствительные бактерии. В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов. Например, если лизис колоний вызван дизентерийным бактериофагом, то выделенные бактерии являются культурой шигелл. Строгая специфичность типовых фагов дает возможность идентифицировать отдельные варианты (фаговары) внутри вида. Таким образом обычно типируют золотистый стафилококк и возбудитель брюшного тифа. Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет расшифровывать эпидемиологические цепочки, т.е. установить источник инфекции.

Диагностические бактериофаги широко применяют для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время широко применяют фагодиагностику и фаготипирование бактерий родов Salmonella, Vibrio и Staphylococcus.

Особое значение имеет их применение в экспресс-диагностике особо опасных инфекций (чума, холера, сибирская язва и др.), т.к. позволяет быстро идентифицировать возбудитель и своевременно организовать карантинные мероприятия.

Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеванийаотаэпидемических. В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

Фаготипирование. Для типирования бактерий суточную агаровую культуру испытуемого штамма засевают в 2,5 мл бульона Хоттингера или мясо-пептонного бульона (рН 7,2-7,4) и культивируют 3-4 часа при 37°С (до появления помутнения, видимого невооруженным глазом). Одновременно в чашки Петри заливают по 25-30 мл 1,2% агара на бульоне Хоттингера, дополненным внесением свежей мясной воды (рН 7,5±0,1), 0,4% глюкозы и CaCl₂. Хлористый кальций добавляют в расплавленный агар непосредственно перед разливом (из расчета 0,2 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl₂ на 100 мл агара). Чашки Петри, накрывают стерильными фильтрами и после застывания подсушивают 30-40 минут при 36-37 С. Затем чашки засевают исследуемой бульонной культурой с помощью пастеровской пипетки «газоном». Избыток культуры удаляют пипеткой. Открытую чашку с агаром накрывают стерильным фильтром и подсушивают 30-40 минут 36-37 °С.

Дно засеянной чашки расчерчивают маркером на 23 квадрата (по числу типовых бактериофагов) и в каждый квадрат засеянной чашки петлей диаметром, 2мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего бактериофага всегда в одном и том же порядке (таблица 2).

Таблица 2 - Расположение бактериофагов на квадратах чашки Петри

29	52	52А	79	80
3А	ЗС	55	71	6
42Е	47	53	54	75
77	83А	84	85	94
96	81	95

После нанесения на газон культуры одного из бактериофагов петля прожигается, а пастеровская пипетка меняется.

При нанесении бактериофагов следует избегать касания пипеткой поверхности агара во избежание возможности переноса культуры. После подсыхания капель бактериофагов чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют 18-20 часов при 30 °С, либо 5-6 часов при 36-37 °С с последующим культивированием течение 20-22 часов при комнатной температуре.

На чашке образовались негативные колонии на квадратах №77 и №81. (рис. 5).

Рисунок 5 - Учет результатов культуры S. aureus при фаготипировании

Исследование начинают рабочим разведением бактериофагов, соответствующим 1 ТР (титр разведения, в нашем примере разведение 10‾³).

При наличии отрицательного результата (отсутствие учитываемого лизиса хотя бы с одним бактериофагом), культуры типируют повторно разведением бактериофагов, соответствующим 100 ТР (в нашем примере - разведение 10‾¹).

Учет и регистрация результатов. Результаты выражают в «крестах»:

«++++» — сливной (полный) лизис;

«+++» — полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса);

«++» — наличие в месте нанесения капли бактериофага свыше 50 колоний бактериофага (пятен лизиса);

«+» — от 20 до 50 колоний бактериофага;

«±» — менее 20 колоний бактериофага;

«» — полное отсутствие лизиса.

Для упрощения схемы учета степени лизиса, результаты, результаты «++++», «+++», «++» — обозначают как «сильная реакция».

При типировании бактериофагами возможен еще один результат, называемый «ингибицией» (подавлением) и обозначаемый «0». Также некоторые бактериофаги могут давать неспецифическое подавление роста бактерий в виде истончения газона в месте нанесения бактериофага. Однако, при разведении такого бактериофага негативных колоний не выявляют.

Штамм считают типируемым, если хотя бы один бактериофаг вызвал «сильную реакцию». Если при использовании 1 ТР и 100 ТР получены только «слабые реакции», обозначаемые «+» или «±», либо лизис полностью отсутствует, то такой штамм следует считать нетипируемым. Результаты типирования регистрируют, записывая против названия штамма разведения бактериофагов, с помощью которых был получен положительный результат (1 ТР или 100 ТР), а также номера бактериофагов, обусловивших «сильную реакцию». Отдельно, в скобках следует записывать наличие «слабых реакций», если таковые имелись. При учете результатов записывают фагогруппы стафилококков (таблица 3).

Таблица 3 - Фагогруппы стафилококков

Фагогруппы	Номера бактериофагов
I	29, 52, 52А,79, 80
II	3А, 3С, 55, 71
III	6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77,83А, 84, 85
V	94, 96
Вне групп	81,95

Например, штамм №3564 1 ТР 6++, 47++, 53++, (42E±). Фагомозаика этого штамма 6/47/53+ где ± означает наличие дополнительной «слабой реакции». Полученный результат дает основание отнести штамм №3564 к III-ей фагогруппе. Штаммы золотистых стафилококков чаще лизируются не одним, а несколькими бактериофагами, что дает для каждого штамма характерную для него фагомозаику. В зависимости от бактериофагов, входящих в эту фагомозаику, штаммы стафилококков относят к тем или иным фагогруппам: I, II, III, смешанная I+III и т.д.

Если штаммы обнаруживают одну и ту же фагомозаику, то они идентичны. Если фагомозаики различаются на 1, 2 и более «сильных реакций» в качестве ориентировочной установки следует принять правило: культуры стафилококка при типировании в один и тот же день, дающие фагомозаики, различающие на 1 «сильную реакцию», следует считать идентичными; если разница составляет 2 и более «сильных реакций», штаммы следует признать разными.

Например: штамм №3564 1ТР 6++, 47++, 53++, (42Е±)

штамм №3565 1ТР 47++, 53++

штамм №3566 1ТР 47++, 75++

Штаммы №3564, 3565 можно считать идентичными (различие на 1 «сильную реакцию» - бактериофаг 6), а штамм №3566 - отличным от них (различие на 2-3 «сильных реакции» - бактериофаги 53, 75, 6).

Для получения правильного ответа в каждом отдельном случае необходимо иметь, по возможности, наиболее полную информацию о выделенной культуре: источник и дату выделения, патогенные свойства, чувствительность к антибиотикам и т.д.

Также фаготипирование проводят для определения неизвестного фага с помощью известной тест-культуры микроорганизмов. Например, если исследуемый бактериофаг лизирует культуру возбудителя холеры, то это холерный бактериофаг.

Кроме того, в диагностике инфекционных заболеваний нашел применение ускоренный метод с помощью реак­ции нарастания титра фага (РНТФ), не требующей выделения чистой культуры возбудителя.

Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный известный бактериофаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон. После культивирования в термостате определяют титр фага по методу Грациа. Наростание титра (числа негативных колоний) фага в 5 раз и более говорит о том, что в исследуемом материале есть соответствующие возбудители, в которых фаг репродуцировался.