- •1. Эволюция клетки, одноклеточные и многоклеточные организмы, прокариоты и эукариоты уровни организации живой материи.
- •2. Структура нуклеиновых кислот.
- •3. Синтез днк: вилка репликации, «ведущая» и «отстающая» нити при репликации. Фрагменты Оказаки.
- •4. Комплекс белков в репликационной вилке.
- •7 Вопрос. Опыт Месельсон – Сталь, доказывающий полуконсервативный метод репликации днк.
- •8 Вопрос. Опыты Гриффиса и Авери, доказывающие, что днк – наследуемая структура.
- •9. Выделение плазмидной днк
- •15.Гибридизация нуклеиновых кислот. Саузерн- и нозерн-блоттинг.
- •16. Разделение и анализ фрагментов днк в агарозном геле. Параметры определяющие скорость прохождения фрагментов днк в агарозном геле. Маркеры молекулярного веса днк.
- •17. Клонирование днк in vivo. Методы трансформации плазмидами. Получение геномной библиотеки с помощью плазмидных векторов. Рекомбинантная днк
- •20.Суть метода пцр
- •Подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению днк или рнк;
- •Собственно полимеразной цепной реакции;
- •Детекции продукта пцр (амплифицированной нуклеиновой кислоты).
- •21. Методы секвенирования: секвенирование днк по Сэнгеру, современные методы секвенирования.
- •1. Джеймс Уотсон
- •2. Френсис Крик
- •3. Морис Уилкинс
- •4. Розалинд Франклин
- •5. Эрвин Чаргафф
- •6. Хар Корана
- •7. Роберт Холлей, Холлей разделил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1968 г. С Харом Гобиндом Картой и Маршаллом Ниренбергом «за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белка
- •8. Маршал Ниренберг
- •9. Кэри Мюллис
- •10. Майкл Смит
- •15. Элизабет Блэкберн
- •16.Кэрол Грейдер
- •17. Джек Шостак.
21. Методы секвенирования: секвенирование днк по Сэнгеру, современные методы секвенирования.
Секвенирование – расшифровка последовательности ДНК.
Методы секвенирования:
а) секвенирование по Сэнгеру;
б) пиросеквенирование;
в) секвенирование следующего поколения;
г) полупроводниковый секвенатор.
Полимеразы, используемые при секвенировании ДНК:
а) Фрагмент Кленова (ДНК-полимеразы I из E.сoli) с отсутствующей экзонуклеазной активностью, расщепляющей ДНК в направлении 5'-3. Фрагмент сохраняет полимеразную и 3'-5' экзонуклеазную активности.
б) Рекомбинантные ДНК-полимеразы, отвечающие следующим требованиям: - отсутствие 3'- и 5'-экзонуклеазной активности,
- отсутствие дискриминации по включению в растущую цепь как обычных, так и модифицированных (меченных) ddNTP.
в) Термостабильные полимеразы для секвенирования:
-Thermo Sequenase™, Amersham Pharmacia Biotech
- AmpliTaq FS™, PE Biosystems
Секвенирование по Сэнгеру:
«Плюс-минус» метод, 1975
В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.
Метод «терминаторов», 1977
В основе метода лежит ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.
№22 Ученые в молекулярной биологии